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层粘蛋白受体(laminin receptor,LR)存在于正常上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、巨噬细胞及大部分肿瘤细胞的表面。通过跨膜,层粘蛋白受体参与机体信号转导的过程。分子量为37kDa的层粘蛋白受体前体蛋白,通过翻译后加工,经酰基化后,依靠分子内疏水作用形成二聚体,转变为成熟的67kDa的层粘蛋白受体,发挥其生理和病理作用。层粘蛋白受体是一个多功能蛋白,与多种类型疾病及其进程密切相关,因而引起了人们对它的巨大关注。研究表明,层粘蛋白受体在细胞增殖、分化、迁移、粘附、胚胎发育、神经生长以及肿瘤发生、癌变与转移等方面发挥着重要作用。特别是在动物传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies,TSEs)的发生发展过程中,层粘蛋白受体介导朊蛋白(prion protein,PrP)与细胞的结合和内化,与朊蛋白在细胞内互作,是朊蛋白的受体蛋白。这更加引起了人们的关注,是研究这类疾病发生和发展过程中信号传导途径的标志蛋白,成为了神经退行性疾病研究领域的新热点。SD大鼠是研究多种疾病发病机理的理想实验动物之一,它具有发病快、症状典型的特点,对于研究多种疾病的发生机理具有重要意义。
本研究中,利用分子生物学技术和免疫组织化学技术,对SD大鼠层粘蛋白受体的全基因进行了克隆、表达,对层粘蛋白受体在SD大鼠组织中的分布进行了研究,为进一步探明层粘蛋白受体的功能及其在疾病发生、发展过程中的作用提供了基础数据。本研究共分为3部分内容:
1.SD大鼠层粘蛋白受体基因的克隆及序列分析。以SD大鼠总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增了SD大鼠层粘蛋白受体基因,并将其克隆到pMD18-T载体中进行测序,运用分子生物学软件对所获得的序列进行了分析。结果表明,所克隆的SD大鼠层粘蛋白受体基因的ORF片段包含了朊蛋白基因的完整编码区,共888个核苷酸,该基因内无内含子,编码295个氨基酸的前体蛋白,推测其相对分子质量约32.6 kDa。与已报道的绵羊、家鼠、猪、牛、人相应序列作比较,发现其核苷酸序列和氨基酸序列具有较高的同源性。氨基酸序列分析表明,SD大鼠层粘蛋白受体的氨基酸点突变位点为V176M,G243E。
2.SD大鼠层粘蛋白受体的原核表达。以含有SD大鼠层粘蛋白受体基因的重组质粒pMD18-T—LR为模板,扩增带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的全基因片段,亚克隆至表达载体pET—32a(+),成功构建了原核表达质粒pET—32a—LR,转化宿主菌BL21(DE3)后,采用不同温度和不同浓度的IPTG诱导表达,成功地筛选到了最佳表达条件,经SDS-PAGE分析和Western blotting免疫印迹鉴定,表达蛋白为SD大鼠层粘蛋白受体,分子量约为37kDa。
3.SD大鼠层粘蛋白受体的组织学定位。利用免疫组织化学技术,对SD大鼠层粘蛋白受体在大脑、小脑、海马、心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结的表达进行了研究,结果表明:层粘蛋白受体在大鼠检测组织内均有表达,表达的细胞类型为大脑、海马和小脑的神经细胞以及心肌细胞、肝细胞、淋巴细胞、支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和肾小管上皮细胞。