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线粒体质量控制(Mitochondrial quality control,MQC)和线粒体相关内质网膜(Mitochondrial-associated membrane,MAM)被认为是众多细胞功能调控的枢纽,与外源化学物暴露导致的神经损伤相关,但靶蛋白的翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)在其中所扮演的角色仍有待进一步阐明。线粒体融合蛋白2(Mitofusin 2,Mfn2)是调节线粒体融合的关键分子,其PTMs对线粒体稳态的调节至关重要。蛋白谷胱甘肽化是氧化还原诱导的一种可逆PTMs,类似于乙酰化和磷酸化修饰影响多种生物过程,如线粒体形态、钙离子稳态、细胞骨架重塑、蛋白质折叠等,在外源环境毒物诱导的神经毒性中发挥重要作用。镉(Cadmium,Cd)及镉化合物(Cd2+)是常见的环境重金属污染物之一,主要通过职业(采矿、电焊)和非职业(接触镉污染的食物、饮水以及吸烟)接触暴露于机体。氯化镉(CdCl2)在体内蓄积主要引起肾毒性、肝毒性和神经毒性。本实验室前期研究发现(1)CdCl2经由内质网应激eIF2a-ATF4信号通路介导环氧合酶2表达升高参与肾损伤;(2)CdCl2暴露引起线粒体动态紊乱调控坏死性凋亡参与CdCl2诱导的肝脏损伤。然而,CdCl2暴露介导的神经毒性损伤作用及MQC过程中Mfn2的谷胱甘肽化修饰(Mfn2-SSG)调控机制,尚有待研究。目的:建立CdCl2暴露介导的神经细胞和神经组织毒理学效应模型,探明CdCl2诱导的Mfn2-SSG参与线粒体动态紊乱和MAM结构破坏、钙离子转运紊乱介导神经细胞坏死性凋亡;探讨Mfn2-SSG干预对坏死性凋亡的调节作用,为CdCl2诱导的神经损伤提供潜在干预靶点和策略。方法:(1)体内试验:评价CdCl2暴露诱导神经损伤:采用SPF级成年雄性BALB/c小鼠(6-8周龄)。采用随机数字表法将小鼠随机分成4组(n=10),分别为对照组(ddH20)、CdCl2暴露组(50 mg/L)、氮乙酰半胱氨酸(NAC)暴露组(1 g/L)和联合暴露组(CdCl2 50 mg/L+NAC lg/L)。通过自由饮水染毒8周。染毒结束后,进行下列检测:①Morris 水迷宫实验检测小鼠学习和记忆功能改变;②电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测镉离子在肝脏、肾脏、海马组织和血清中的含量:③qRT-PCR检测肝脏、肾脏和海马组织中金属硫蛋白Mtl、Mt2和Mt3的mRNA水平;④硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)颜色反应法检测海马组织和血清中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;⑤通过DNTB速率比色法检测海马组织和血清中还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量;⑥WB检测海马组织中Grxl、Grx2、SOD2、a-syn、TH、Mfn2、VCP和坏死性凋亡相关蛋白的表达;⑦分离脑组织MAIM组分检测Mfn2、α-syn和坏死性凋亡蛋白在其中的分布及含量;⑧IHC观察海马组织中a-syn、TH和坏死性凋亡蛋白p-MLKL的表达和分布;⑨HE染色观察海马组织病理改变。(2)体外试验:采用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞给予CdCl2处理,建立毒性损伤模型检测相关指标。①WB检测细胞MQC相关蛋白、线粒体氧化还原相关蛋白、坏死性凋亡相关蛋白和神经功能相关蛋白水平;②激光共聚焦(Confocal)显微镜免疫荧光(I正)技术检测Mfn2与PSSG在线粒体的共定位;③免疫共沉淀实验(Co-IP)检测Mfn2-SSG修饰水平;④邻位连接实验(PLA)检测p-MLKL与a-syn蛋白空间位置的邻近情况;⑤分离MAM组分检测Mfn2、a-syn和坏死性凋亡蛋白在其中的分布及含量;⑥TEM观察细胞MAM结构和间距;⑦高内涵细胞分析(HCA)检测胞质、线粒体、内质网Ca2+水平;⑧构建高低表达GLRXX靶向基因干预细胞模型和高表达MFN2靶向基因干预细胞模型,验证Mfn2在CdCI2诱导神经细胞毒性中的作用;⑨线粒体抗氧化剂(Mito-TEMPO)和总细胞抗氧化剂(NAC)处理建立ROS抑制模型,验证线粒体ROS靶向干预在CdCl2诱导的神经细胞毒性损伤中的作用。结果:(1)体内试验:与对照组小鼠相比,①Morris水迷宫实验检测发现处理组小鼠穿越平台次数显著减少(P<0.05)并且在靶象限停留时间减少,提示CdCl2暴露诱导小鼠学习记忆损伤发生:②ICP-MS检测发现CdCl2处理组小鼠肝脏、肾脏和海马组织中镉离子含量显著升高,提示Cdcl2通过饮水暴露可在肝脏、肾脏和神经组织中蓄积;③qRT-PCR实验检测发现CdCl2处理组小鼠肝脏和肾脏中金属硫蛋白1和2(Mtl和Mt2)呈现不同程度升高(P<0.05),神经系统特异性金属硫蛋白3(M13)在海马组织明显升高(P<0.05),并且在NAC干预CdC12暴露组小鼠海马组织中Mt3水平降低;④TBA颜色反应法和DNTB速率比色法检测氧化应激指标,结果显示,CdCl2处理组小鼠脑组织中MDA和GSSG水平升高(P<0.05),GSH水平降低;而在NAC干预组小鼠中MDA水平降低(P<0.05)、GSSG水平降低(P<0.05);⑤WB结果显示CdCl2处理组小鼠海马中坏死性凋亡蛋白RIPK3、p-MLKL和a-syn蛋白水平升高,而Mfn2和TH水平降低:在NAC干预CdCl2暴露组小鼠中,坏死性凋亡蛋白RIPK3、p-MLKL和a-syn蛋白水平降低,而Mfn2和TH水平升高;IHC结果与WB结果一致,验证了CdCI2诱导神经细胞坏死性凋亡和神经功能的改变。(2)体外试验:与对照组SH-SY5Y细胞相比,①CdCl2处理组细胞坏死性凋亡相关蛋白RIPK3和p-MLKL水平升高,VCP和Grxl蛋白表达水平升高,蛋白谷胱甘肽化水平升高,线粒体动态相关蛋白Mfn2水平下降,线粒体抗氧化蛋白SOD2水平下降:②IF实验观察显示CdCl2处理组细胞镉离子探针的平均荧光强度增强、Mfn2与PSSG在mito-Tracker的共定位增强和氧化型C11-BODIPY荧光强度升高;③Co-IP实验结果显示谷胱甘肽化的蛋白复合物中包含Mfn2蛋白,提示Mfn2可以发生谷胱甘肽化修饰;④PLA结果显示,CdCl2处理组细胞中,p-MLKL-a-syn的荧光信号增强,提示CdCl2诱导p-MLKL和a-syn空间距离邻近:⑤在SH-SY5Y细胞中分离MAM组分,WB结果显示p-MLKL和a-syn共分布在MAM组分上,并且在CdCl2处理组细胞中升高;⑥TEM显示CdCl2暴露组细胞ER-Mito接触减少:⑦HCA结果显示,CdCl2处理组细胞中线粒体Ca2+和胞浆Ca2+平均荧光水平升高,内质网Ca2+平均荧光水平降低,提示CdCl2诱导MAM Ca2+转运功能改变;⑧在GLRXX干预组细胞模型中,与CdCl2处理组相比,敲低表达GLRXl使Mfn2-SSG水平增加,并且增加坏死性凋亡蛋白p-MLKL和RIPK3的表达水平;而高表达GLRXX1使Mfn2-SSG水平降低,并且降低坏死性凋亡蛋白p-MLKL和RIPK3的表达水平,提示Mfn2-SSG参与了CdCl2暴露诱导的神经细胞坏死性凋亡;⑨Mito-TEMPO和NAC干预模型中,与CdCl2处理组相比,Mito-TEMPO和NAC干预组细胞坏死性凋亡蛋白p-MLKL、RIPK3蛋白水平降低,细胞活力回升(P<0.05),提示清除线粒体ROS可以挽救CdCl2暴露诱导的神经毒性。结论:CdCl2暴露可诱导海马组织和神经元细胞中线粒体氧化应激、线粒体融合关键蛋白Mfn2的谷胱甘肽化修饰、MAM结构和功能改变以及坏死性凋亡的发生:诱导的Mfn2-SSG参与调节ER-Mito接触,调节CdCl2暴露诱导的神经细胞坏死性凋亡;高表达GLRXl、MFN2和抗氧化剂干预可抑制CdCl2暴露诱导的神经毒性效应。结果提示CdCl2诱导的神经损伤中Mfn2-SSG可能是潜在的干预靶点。