论文部分内容阅读
目的二硫化碳（CS2）是一种重要的化工原料，可以引起中毒性周围神经病，其发病机制目前还不清楚。本研究通过建立CS2亚慢性中毒大鼠模型，测定中毒大鼠大脑、小脑、脊髓和坐骨神经中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）含量和超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）和过氧化氢酶（CAT）活性的变化，为进一步探讨CS2引起的中毒性周围神经病的发病机制提供依据。并观察脊髓组织中微管和微丝相对含量的变化，利用RT-PCR的方法研究二硫化碳对脊髓组织中微管和微丝在转录水平的影响，初步探索二硫化碳导致骨架蛋白变化的发生机理。方法1．Wistar雄性大鼠60只，体重180～220 g，由山东大学实验动物中心提供。饲养7 d后，随机分为对照组、300mg／kg剂量组、500mg／kg剂量组，每组20只。二硫化碳溶于玉米胚油中，2.5ml／kg体积灌胃腹腔染毒，对照组用同体积玉米油灌胃，5次／周，连续12周。2．密切观察各组大鼠一般状况的变化，每周测量体重，并用神经行为学方法定期测量压痛阈值、后肢撑力、转棒、网格指数等神经行为学指标。3．至试验结束时，断头处死大鼠，取大脑、小脑、脊髓、坐骨神经，用生物化学方法测定大脑、小脑、脊髓和坐骨神经匀浆中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）含量和超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）和过氧化氢酶（CAT）活性的变化。4．分离脊髓组织，制备匀浆，100000×g、4℃离心60min。利用Western-Blotting的方法研究二硫化碳中毒大鼠脊髓组织匀浆上清和沉淀中β-actin、α-tubulin、β-tubulin等骨架蛋白相对含量的变化。5．分离脊髓组织，Trizol法提取组织中总RNA，利用RT-PCR的方法观察β-actin、α-tubulin、β-tubulin mRNA的表达水平。结果1．二硫化碳染毒对大鼠体重和神经行为的影响实验结束时，染毒组大鼠体重和各项行为学指标与对照组相比均有显著性差异，并在整个实验过程中呈现一定的剂量-时间-效应关系。与对照组相比，低剂量组体重降低21％（P＜0．01），高剂量组降低37％（P＜0．01）。高剂量组和低剂量组大鼠在热板仪上保持时间分别从第8和第10周开始比对照组明显延长，至试验结束时，低剂量组延长28％（P＜0．01），高剂量组延长70％（P＜0.01）。与对照组相比，高剂量组和低剂量组大鼠分别从第6和第8周开始对压痛的感觉开始明显迟滞，至试验结束，两组大鼠压痛阈值分别增加33％（P＜0.01）和60％（P＜0.01）。大鼠在网格上停留的时间缩短，至试验结束时，低剂量组和高剂量组大鼠网格指数分别下降了35％（P＜0.01）和42％（P＜0.01）。大鼠的后肢撑力下降，试验结束时，与对照组相比，低剂量组后肢撑力指数增加21％（P＜0.01），高剂量组增加24％（P＜0.01）。2．二硫化碳对神经组织中抗氧化系统的影响（1）大脑中抗氧化系统指标的变化与对照组相比，高剂量组大鼠大脑中MDA和ROS分别上升了33％（P＜0.01）和35％（P＜0.01），而在低剂量组分别上升了20％（P＜0.01）和20％（P＜0.01）。高剂量组大鼠大脑中GSH、GSH-Px、SOD、T-AOC和CAT分别下降了27％（P＜0.01），12％（P＜0.01），30％（P＜0.01），21％（P＜0.01）和40％（P＜0.01）。低剂量组GSH、，T-AOC和CAT分别下降了18％（P＜0.01），11％（P＜0.05）和18％（P＜0.01），GSH-Px与SOD未见明显变化。（2）小脑中抗氧化系统指标的变化与对照组相比，高剂量组大鼠小脑中MDA和ROS分别上升了23％（P＜0.01）和19％（P＜0.01），而在低剂量组分别上升了9％（P＜0.05）和13％（P＜0.05）。高剂量组大鼠小脑中GSH、GSH-Px、SOD、T-AOC和CAT分别下降了27％（P＜0.01），15％（P＜0.01），26％（P＜0.01），21％（P＜0.01）和25％（P＜0.01）。低剂量组GSH下降了10％（P＜0.05），T-AOC、CAT、GSH-Px与SOD未见明显变化。（3）坐骨神经中抗氧化系统指标的变化与对照组相比，高剂量组大鼠坐骨神经中MDA和ROS分别上升了23％（P＜0.01）和53％（P＜0.01），低剂量组MDA上升了23％（P＜0.01），ROS未见明显改变。高剂量组大鼠坐骨神经中GSH、GSH-Px、SOD、T-AOC和CAT分别下降了20％（P＜0.01），21％（P＜0.01），30％（P＜0.01），42％（P＜0.01）和37％（P＜0.01）。而在低剂量组GSH、GSH-Px、SOD、T-AOC和CAT分别下降了15％（P＜0.05），17％（P＜0.01），17％（P＜0.01），36％（P＜0.01）和17％（P＜0.01）。（4）脊髓中抗氧化系统指标的变化与对照组相比，高剂量组大鼠脊髓组织中MDA和ROS分别上升了23％（P＜0.01）和14％（P＜0.01），低剂量组MDA上升了18％（P＜0.05），ROS未见明显改变。高剂量组大鼠脊髓组织中GSH、GSH-Px、SOD、T-AOC和CAT分别下降了31％（P＜0.01），32％（P＜0.01），25％（P＜0.01），28％（P＜0.01）和31％（P＜0.01）。而在低剂量组GSH、GSH-Px、SOD、T-AOC和CAT分别下降了26％（P＜0.05），17％（P＜0.01），12％（P＜0.01），14％（P＜0.05）和25％（P＜0.01）。3．二硫化碳对脊髓组织中细胞骨架蛋白含量的影响二硫化碳染毒引起大鼠脊髓中β-tubulin和β-actin含量明显改变。在脊髓上清中，低剂量组和高剂量组大鼠的β-tubulin含量较对照分别升高了141％和158％（P＜0.01），β-actin的含量分别升高了19％和32％（P＜0.01）。在脊髓沉淀中，低剂量组和高剂量组大鼠的β-tubulin含量较对照分别增加了107％和118％（P＜0.01），但β-actin的含量无明显改变。α-tubulin含量均无明显变化。4．二硫化碳对脊髓组织中微管和微丝mRNA表达水平的影响RT-PCR结果显示，在脊髓组织中，与对照组相比，3低剂量组和高剂量组大鼠β-tubulin的mRNA水平分别升高了207％和212％（P＜0.01），β-actin的mRNA水平升高了94％和91％（P＜0.01）。然而，α-tubulin的mRNA水平无显著性改变。结论1．二硫化碳具有明显的神经毒性，可损伤感觉和运动神经功能。2．二硫化碳可使大鼠大脑、小脑、脊髓、坐骨神经组织的氧化—抗氧化系统失衡，诱导脂质过氧化发生，并且具有明显的剂量依赖性，可能是其诱导中毒性神经病的发病机制之一。3．二硫化碳染毒导致大鼠脊髓上清和沉淀中微管和微丝蛋白含量发生了改变，其中尤以β-微管蛋白含量增加最为明显。4．二硫化碳染毒引起大鼠脊髓中微管和微丝蛋白表达发生了显著改变，这种改变可能与二硫化碳的外周神经毒性有关。