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目的：1.临床观察：通过临床观察慢性心力衰竭患者不同中医证型与心率变异性(HRV)、神经生长因子(NGF)和白血病抑制因子(LIF)之间的变化，探讨中医证型变化与自主神经病变规律的关系，以及NGF、LIF和HRV之间的相关关系。2.实验研究：通过观察盐敏感高血压诱导的慢性心力衰竭大鼠不同时期NGF、LIF表达与心脏交感神经解剖学和功能学支配异常的动态变化，证明NGF、LIF表达是影响交感神经解剖学和功能学支配的重要分子机制；通过观察桂枝汤对心衰失代偿期NGF、LIF表达的影响，证明桂枝汤可通过调节NGF、LIF表达改善心衰心脏交感神经重塑。
方法：1.临床观察：根据《慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识》和《中药新药临床研究指导原则》纳入慢性心衰中医辨证属阴虚证型者50例，阳虚证型患者53例，同时纳入健康体检者46例作为健康对照组，观察各组相关HRV、NGF、LIF、左室射血分数(LVEF)、N末端B型脑钠肽前体(NT-proBNP)、心功能分级(NYHA)和Lee氏心衰积分的变化。2.实验研究：(1)选用6周龄DS雄性大鼠和SS-13BN雄性大鼠各27只，高盐饮食饲养(8%，NaCl)。选择高盐饮食饲养开始后第6、9、12周作为心衰发展的心肌肥厚期、代偿期和失代偿期，每个时间点各取9只大鼠处死检测相关指标，另取DS大鼠和SS-13BN大鼠各3只用于HRV检测。通过心脏超声和NT-proBNP检测证明成功诱导心衰；心电图检测反应大鼠心率和P-R间期改变；HE和Masson染色分别检测大鼠心肌形态学和胶原沉积；HRV监测用于反映自主神经调节能力；检测心肌去甲肾上腺素(NA)、酪氨酸羟化酶(TH)含量和血浆NA含量用于反映交感神经末端去甲肾上腺素的合成、释放和重吸收功能；Westernblotting检测心肌中生长相关蛋白43(GAP43)、多唾液酸神经细胞黏附因子(PSA-NCAM)表达，TH/GAP43双抗体免疫荧光定位心脏交感神经再生，GAP43/PSA-NCAM确定新生的交感神经为不成熟神经分布，即“再生幼稚化”现象；检测心肌TH和胆碱乙酰氨基转移酶(ChAT)(双抗体免疫荧光和Westernblotting)，同时透射电镜(TEM)观察左心室和星状神经节神经末端颗粒囊泡(SGV)和无颗粒囊泡(SAGV)变化，以反映心脏和星状神经节中交感神经和迷走神经的分布，证明交感神经出现“胆碱能性质转化”；检测心肌NGF、LIF蛋白和mRNA表达反映心脏NGF、LIF的动态变化趋势。(2)6周龄DS雄性大鼠，分为模型组(DS组，9只)和桂枝汤组(GS组，9只)，另取SS-13BN大鼠作为正常对照组(SS-13BN组，9只)。GS组灌胃剂量为桂枝汤水煎剂4.0g生药/Kg/日，DS组和SS-13BN组给予生理盐水(2mL/日)灌胃。各组大鼠均给予高盐饮食(8%，NaCl)饲养，于开始高盐饮食第10周末即开始桂枝汤灌胃，持续灌胃4周后处死检测。一般指标检测：体重、血压、心脏彩超、心电图；HE和Masson染色检测心肌组织形态学和胶原改变；Elisa法检测心肌、血浆NA含量和血浆NT-proBNP水平；RT-PCR/Westernblotting检测心脏组织NGF和LIFmRNA/蛋白表达；Westernblotting检测心脏TH、CHAT、GAP43、PSA-NCAM蛋白表达；双抗体免疫荧光检测TH/ChAT，电镜观察左心室和星状神经节神经末端颗粒囊泡(SGV)和无颗粒囊泡(SAGV)变化，证明交感神经“胆碱能性质转化”；TH/GAP43双抗体免疫荧光定位心脏组织交感神经再生，GAP43/PSA-NCAM确定新生的交感神经“再生幼稚化”现象。
结果：1.临床观察：阴虚证型组和阳虚证型组心衰患者HRV(SDNN、RMSSD、LF、HF)水平均低于健康对照组(P＜0.05或0.01)，阳虚证型组反应自主神经总体调节功能的SDNN指标低于阴虚证型组(P＜0.01)，反应迷走神经功能的RMSSD和HF指标两组比较无统计学差异(P＞0.05)，阳虚证型组反应交感神经功能的LF指标低于阴虚证型组(P＜0.01)，应交感-迷走神经支配平衡的LF/HF指标阴虚证型组高于健康对照组(P＜0.05)，阳虚证型组低于健康对照组(P＜0.05)，阳虚证型组LF/HF比值显著低于阴虚证型组(P＜0.01)。阴虚证型组NGF指标显著高于健康对照组(P＜0.01)，阳虚证型组NGF指标低于健康对照组(P＜0.05)，阴虚证型组和阳虚证型组LIF指标均高于健康对照组(P＜0.01)，阳虚证组LIF指标高于阴虚证型组(P＜0.01)。单因素相关分析显示，NGF与SDNN、LF之间存在正相关关系(P＜0.05或0.01)，LIF与SDNN和LF呈负相关关系(P＜0.01)，多元线性回归分析显示，NGF与SDNN、LF之间存在正相关性(P＜0.05)，LIF与SDNN、LF呈负相关性(P＜0.01)。在心功能方面，阳虚证型组LVEF指标显著低于阴虚证组(P＜0.01)，Lee氏心衰总积分、NT-proBNP水平和心功能NYHA分级显著高于阴虚证组(P＜0.01)。实验研究：(1)一般指标显示：高盐饮食6-12周，与SS-13BN组比较，DS组大鼠体重下降，血压升高，心率减慢，P-R间期延长，心功能出现了明显损伤(NT-proBNP、LVEF)；心率变异性显示：DS组大鼠交感-迷走神经平衡指标LF/HF比值在高盐饮食第6周高于SS-13BN组(P＜0.05)，在高盐饮食第12周显著低于SS-13BN组(P＜0.01)；Elisa检测显示：与SS-13BN组比较，DS组大鼠心肌组织NA水平下降(P＜0.05)，血浆NA水平持续升高(P＜0.05)；HE、Masson染色示：随着心衰病程进展，DS组大鼠心肌细胞体积增大，心肌间隙增宽，炎症浸润，呈磨玻璃样变性，心肌纤维紊乱，并存在大量胶原沉积；RT-PCR/Westernblotting检测显示：与SS-13BN组比较，DS组大鼠NGFmRNA和蛋白表达先升高后降低(P＜0.05)，LIFmRNA和蛋白表达则持续升高(P＜0.05)；神经标志物蛋白表达显示：DS组大鼠TH、GAP43、PSA-NCAM蛋白水平表达在高盐饮食第6周高于SS-13BN组(P＜0.05)，在高盐饮食第12周TH、GAP43蛋白水平低于SS-13BN组(P＜0.05)，PSA-NCAM蛋白水平虽下降但仍高于SS-13BN组(P＜0.01)，CHAT蛋白水平先降低后相对性增加，但仍低于SS-13BN组，但无统计学意义(P＞0.05)；双抗体免疫荧光显示：与SS-13BN组比较，DS组大鼠TH+/GAP43+、GAP43+/PSA-NCAM+阳性神经纤维共表达均先增加后降低(P＜0.05)，TH+/CHAT+荧光双染TH+阳性神经纤维分布先增加后减少，CHAT+阳性神经纤维分布先轻度降低后相对性的增加，但一直低于SS-13BN组；左心室和星状神经节电镜显示：与SS-13BN组比较，DS组大鼠交感神经含颗粒囊泡(SGV)损坏，出现大量空泡，迷走神经无颗粒囊泡(SAGV)相对性的增加。研究结果提示：由心肌肥厚期向代偿期再到失代偿期转化过程中，交感神经由解剖学由高支配向低支配转化，其功能学支配则持续降低。(2)一般指标显示：与DS组大鼠比较，在心衰失代偿期，桂枝汤可延缓GS组大鼠体重下降，降低血压，增加心率，缩短P-R间期，提高心脏功能(NT-proBNP、LVEF)；心率变异性显示：GS组大鼠交感-迷走神经平衡指标LF/HF比值升高(P＜0.05)；Elisa检测显示：GS组大鼠心肌组织NA水平上升(P＜0.05)，血浆NA水平下降(P＜0.05)；HE、Masson染色示：桂枝汤灌胃组大鼠心肌细胞体积减小，排列较整齐，心肌间隙变小，炎症浸润明显降低，心肌纤维排列较整齐，胶原损伤显著减少；RT-PCR/Westernblotting检测显示：桂枝汤可升高心脏NGFmRNA和蛋白表达(P＜0.05)，降低心脏LIFmRNA和蛋白表达(P＜0.05)；双抗体免疫荧光和神经标志物蛋白表达显示：桂枝汤可以增加TH+/GAP43+阳性神经纤维共表达(P＜0.05)，提高TH+/CHAT+荧光中TH+阳性神经纤维分布，对CHAT+阳性神经纤维无作用，对GAP43+/PSA-NCAM+阳性神经纤维共表达水平无统计学差异(P＞0.05)，神经标志物蛋白TH和GAP43表达均上调，而对CHAT、PSA-NCAM蛋白表达无影响(P＞0.05)；左心室和星状神经节电镜显示：桂枝汤可修复GS组大鼠交感神经含颗粒囊泡(SGV)损坏，减轻交感神经囊泡损伤。研究结果提示：在心衰失代偿期，桂枝汤可通过上调心脏NGF表达促进交感神经再生，提高交感神经解剖学支配，下调心脏LIF水平抑制交感神经“胆碱能性质转化”，增加交感神经功能学支配。
结论：1.临床观察：慢性心衰不同中医证型存在相应的交感和迷走神经异常改变，阴虚证型组以交感神经亢进为主，阳虚证型组以交感神经功能损伤为主，两组均存在不同程度的迷走神经损伤，随着心衰病程进展，自主神经病变程度逐渐加大。慢性心衰患者自主神经指标(SDNN、LF)与NGF、LIF存在相关性，NGF与自主神经存在正相关性，LIF与自主神经存在负相关性，可以认为NGF、LIF是反应心脏自主神经病变的重要神经因子，而调节NGF、LIF，可能起到改善心衰自主神经病变的作用。2.实验研究：(1)盐敏感高血压导致的心力衰竭大鼠心肌肥厚期，心脏NGF水平表达升高，诱导交感神经再生水平增加，导致心脏交感神经解剖学高支配。同时，上调的LIF诱导新生的交感神经出现“再生幼稚化”现象，对抗交感神经在心肌肥厚期的过度支配。由心肌肥厚期向代偿期再到失代偿期过程中，心脏NGF表达下调，交感神经再生水平下降，交感神经表现出解剖学失支配，而LIF表达持续升高，诱导交感神经向“胆碱能性质转化”，导致交感神经出现功能学失支配。(2)桂枝汤可提高心衰失代偿期交感神经再生水平，抑制交感神经“胆碱能性质转化”，改善交感神经解剖学低支配和功能学失支配，调节交感神经解剖学和功能学支配平衡，其作用机制与调节NGF、LIF表达密切相关。
方法：1.临床观察：根据《慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识》和《中药新药临床研究指导原则》纳入慢性心衰中医辨证属阴虚证型者50例，阳虚证型患者53例，同时纳入健康体检者46例作为健康对照组，观察各组相关HRV、NGF、LIF、左室射血分数(LVEF)、N末端B型脑钠肽前体(NT-proBNP)、心功能分级(NYHA)和Lee氏心衰积分的变化。2.实验研究：(1)选用6周龄DS雄性大鼠和SS-13BN雄性大鼠各27只，高盐饮食饲养(8%，NaCl)。选择高盐饮食饲养开始后第6、9、12周作为心衰发展的心肌肥厚期、代偿期和失代偿期，每个时间点各取9只大鼠处死检测相关指标，另取DS大鼠和SS-13BN大鼠各3只用于HRV检测。通过心脏超声和NT-proBNP检测证明成功诱导心衰；心电图检测反应大鼠心率和P-R间期改变；HE和Masson染色分别检测大鼠心肌形态学和胶原沉积；HRV监测用于反映自主神经调节能力；检测心肌去甲肾上腺素(NA)、酪氨酸羟化酶(TH)含量和血浆NA含量用于反映交感神经末端去甲肾上腺素的合成、释放和重吸收功能；Westernblotting检测心肌中生长相关蛋白43(GAP43)、多唾液酸神经细胞黏附因子(PSA-NCAM)表达，TH/GAP43双抗体免疫荧光定位心脏交感神经再生，GAP43/PSA-NCAM确定新生的交感神经为不成熟神经分布，即“再生幼稚化”现象；检测心肌TH和胆碱乙酰氨基转移酶(ChAT)(双抗体免疫荧光和Westernblotting)，同时透射电镜(TEM)观察左心室和星状神经节神经末端颗粒囊泡(SGV)和无颗粒囊泡(SAGV)变化，以反映心脏和星状神经节中交感神经和迷走神经的分布，证明交感神经出现“胆碱能性质转化”；检测心肌NGF、LIF蛋白和mRNA表达反映心脏NGF、LIF的动态变化趋势。(2)6周龄DS雄性大鼠，分为模型组(DS组，9只)和桂枝汤组(GS组，9只)，另取SS-13BN大鼠作为正常对照组(SS-13BN组，9只)。GS组灌胃剂量为桂枝汤水煎剂4.0g生药/Kg/日，DS组和SS-13BN组给予生理盐水(2mL/日)灌胃。各组大鼠均给予高盐饮食(8%，NaCl)饲养，于开始高盐饮食第10周末即开始桂枝汤灌胃，持续灌胃4周后处死检测。一般指标检测：体重、血压、心脏彩超、心电图；HE和Masson染色检测心肌组织形态学和胶原改变；Elisa法检测心肌、血浆NA含量和血浆NT-proBNP水平；RT-PCR/Westernblotting检测心脏组织NGF和LIFmRNA/蛋白表达；Westernblotting检测心脏TH、CHAT、GAP43、PSA-NCAM蛋白表达；双抗体免疫荧光检测TH/ChAT，电镜观察左心室和星状神经节神经末端颗粒囊泡(SGV)和无颗粒囊泡(SAGV)变化，证明交感神经“胆碱能性质转化”；TH/GAP43双抗体免疫荧光定位心脏组织交感神经再生，GAP43/PSA-NCAM确定新生的交感神经“再生幼稚化”现象。
结果：1.临床观察：阴虚证型组和阳虚证型组心衰患者HRV(SDNN、RMSSD、LF、HF)水平均低于健康对照组(P＜0.05或0.01)，阳虚证型组反应自主神经总体调节功能的SDNN指标低于阴虚证型组(P＜0.01)，反应迷走神经功能的RMSSD和HF指标两组比较无统计学差异(P＞0.05)，阳虚证型组反应交感神经功能的LF指标低于阴虚证型组(P＜0.01)，应交感-迷走神经支配平衡的LF/HF指标阴虚证型组高于健康对照组(P＜0.05)，阳虚证型组低于健康对照组(P＜0.05)，阳虚证型组LF/HF比值显著低于阴虚证型组(P＜0.01)。阴虚证型组NGF指标显著高于健康对照组(P＜0.01)，阳虚证型组NGF指标低于健康对照组(P＜0.05)，阴虚证型组和阳虚证型组LIF指标均高于健康对照组(P＜0.01)，阳虚证组LIF指标高于阴虚证型组(P＜0.01)。单因素相关分析显示，NGF与SDNN、LF之间存在正相关关系(P＜0.05或0.01)，LIF与SDNN和LF呈负相关关系(P＜0.01)，多元线性回归分析显示，NGF与SDNN、LF之间存在正相关性(P＜0.05)，LIF与SDNN、LF呈负相关性(P＜0.01)。在心功能方面，阳虚证型组LVEF指标显著低于阴虚证组(P＜0.01)，Lee氏心衰总积分、NT-proBNP水平和心功能NYHA分级显著高于阴虚证组(P＜0.01)。实验研究：(1)一般指标显示：高盐饮食6-12周，与SS-13BN组比较，DS组大鼠体重下降，血压升高，心率减慢，P-R间期延长，心功能出现了明显损伤(NT-proBNP、LVEF)；心率变异性显示：DS组大鼠交感-迷走神经平衡指标LF/HF比值在高盐饮食第6周高于SS-13BN组(P＜0.05)，在高盐饮食第12周显著低于SS-13BN组(P＜0.01)；Elisa检测显示：与SS-13BN组比较，DS组大鼠心肌组织NA水平下降(P＜0.05)，血浆NA水平持续升高(P＜0.05)；HE、Masson染色示：随着心衰病程进展，DS组大鼠心肌细胞体积增大，心肌间隙增宽，炎症浸润，呈磨玻璃样变性，心肌纤维紊乱，并存在大量胶原沉积；RT-PCR/Westernblotting检测显示：与SS-13BN组比较，DS组大鼠NGFmRNA和蛋白表达先升高后降低(P＜0.05)，LIFmRNA和蛋白表达则持续升高(P＜0.05)；神经标志物蛋白表达显示：DS组大鼠TH、GAP43、PSA-NCAM蛋白水平表达在高盐饮食第6周高于SS-13BN组(P＜0.05)，在高盐饮食第12周TH、GAP43蛋白水平低于SS-13BN组(P＜0.05)，PSA-NCAM蛋白水平虽下降但仍高于SS-13BN组(P＜0.01)，CHAT蛋白水平先降低后相对性增加，但仍低于SS-13BN组，但无统计学意义(P＞0.05)；双抗体免疫荧光显示：与SS-13BN组比较，DS组大鼠TH+/GAP43+、GAP43+/PSA-NCAM+阳性神经纤维共表达均先增加后降低(P＜0.05)，TH+/CHAT+荧光双染TH+阳性神经纤维分布先增加后减少，CHAT+阳性神经纤维分布先轻度降低后相对性的增加，但一直低于SS-13BN组；左心室和星状神经节电镜显示：与SS-13BN组比较，DS组大鼠交感神经含颗粒囊泡(SGV)损坏，出现大量空泡，迷走神经无颗粒囊泡(SAGV)相对性的增加。研究结果提示：由心肌肥厚期向代偿期再到失代偿期转化过程中，交感神经由解剖学由高支配向低支配转化，其功能学支配则持续降低。(2)一般指标显示：与DS组大鼠比较，在心衰失代偿期，桂枝汤可延缓GS组大鼠体重下降，降低血压，增加心率，缩短P-R间期，提高心脏功能(NT-proBNP、LVEF)；心率变异性显示：GS组大鼠交感-迷走神经平衡指标LF/HF比值升高(P＜0.05)；Elisa检测显示：GS组大鼠心肌组织NA水平上升(P＜0.05)，血浆NA水平下降(P＜0.05)；HE、Masson染色示：桂枝汤灌胃组大鼠心肌细胞体积减小，排列较整齐，心肌间隙变小，炎症浸润明显降低，心肌纤维排列较整齐，胶原损伤显著减少；RT-PCR/Westernblotting检测显示：桂枝汤可升高心脏NGFmRNA和蛋白表达(P＜0.05)，降低心脏LIFmRNA和蛋白表达(P＜0.05)；双抗体免疫荧光和神经标志物蛋白表达显示：桂枝汤可以增加TH+/GAP43+阳性神经纤维共表达(P＜0.05)，提高TH+/CHAT+荧光中TH+阳性神经纤维分布，对CHAT+阳性神经纤维无作用，对GAP43+/PSA-NCAM+阳性神经纤维共表达水平无统计学差异(P＞0.05)，神经标志物蛋白TH和GAP43表达均上调，而对CHAT、PSA-NCAM蛋白表达无影响(P＞0.05)；左心室和星状神经节电镜显示：桂枝汤可修复GS组大鼠交感神经含颗粒囊泡(SGV)损坏，减轻交感神经囊泡损伤。研究结果提示：在心衰失代偿期，桂枝汤可通过上调心脏NGF表达促进交感神经再生，提高交感神经解剖学支配，下调心脏LIF水平抑制交感神经“胆碱能性质转化”，增加交感神经功能学支配。
结论：1.临床观察：慢性心衰不同中医证型存在相应的交感和迷走神经异常改变，阴虚证型组以交感神经亢进为主，阳虚证型组以交感神经功能损伤为主，两组均存在不同程度的迷走神经损伤，随着心衰病程进展，自主神经病变程度逐渐加大。慢性心衰患者自主神经指标(SDNN、LF)与NGF、LIF存在相关性，NGF与自主神经存在正相关性，LIF与自主神经存在负相关性，可以认为NGF、LIF是反应心脏自主神经病变的重要神经因子，而调节NGF、LIF，可能起到改善心衰自主神经病变的作用。2.实验研究：(1)盐敏感高血压导致的心力衰竭大鼠心肌肥厚期，心脏NGF水平表达升高，诱导交感神经再生水平增加，导致心脏交感神经解剖学高支配。同时，上调的LIF诱导新生的交感神经出现“再生幼稚化”现象，对抗交感神经在心肌肥厚期的过度支配。由心肌肥厚期向代偿期再到失代偿期过程中，心脏NGF表达下调，交感神经再生水平下降，交感神经表现出解剖学失支配，而LIF表达持续升高，诱导交感神经向“胆碱能性质转化”，导致交感神经出现功能学失支配。(2)桂枝汤可提高心衰失代偿期交感神经再生水平，抑制交感神经“胆碱能性质转化”，改善交感神经解剖学低支配和功能学失支配，调节交感神经解剖学和功能学支配平衡，其作用机制与调节NGF、LIF表达密切相关。