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背景近年来嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T)逐渐兴起,并在非实体瘤(白血病和淋巴瘤)治疗中起到很好的治疗效果,但是其技术缺陷也较为明显,例如会出现脱靶效应、细胞因子风暴、CAR-T细胞体内长期存活、插入突变等;并且在实体瘤治疗中,尚未取得显著疗效。因此针对NK细胞的CAR修饰开始成为研究热点。CAR-NK的设计思路沿袭了经典CAR-T的设计思路,是对NK细胞的生物特点的再创新和进一步发展。在人体中,不同来源的NK细胞具有不同生物学特点,如干细胞分化来源NK细胞、分离培养的NK细胞系和外周血NK细胞系,这些特点在CAR-NK研发中被广泛运用。已有的报道中,体外实验和动物模型均证明CAR-NK在靶向治疗多种血液肿瘤和实体瘤均疗效显著。CAR-NK对肿瘤细胞的杀伤,主要是通过释放细胞因子、细胞毒性颗粒实现的。而对于无细胞因子和细胞毒性颗粒释放但具备杀伤功能的CAR-NK现象,目前还尚未报道,提示此研究对发展CAR-NK抗肿瘤免疫治疗具有重要意义。目的利用全基因合成技术,构建嵌合共刺激转换受体,改造NK92细胞(即CCCR-NK92),提高NK92细胞的抗肿瘤治疗效果。从细胞结构学、形态学以及组织学去探究CCCR-NK92除释放细胞因子及细胞毒颗粒之外的抗肿瘤机制。方法提取重组质粒,主质粒是含PD1-NKG2D-41BB-pCDH的载体质粒,包病毒后收集病毒上清,浓缩病毒,用浓缩的病毒转染NK92细胞,得到CCCR-NK92细胞就是表达嵌合共刺激转换受体的NK92细胞。CCCR-NK92细胞转染效率用流式细胞术检测分析,HE染色和瑞氏染色检测CCCR-NK92细胞形态学改变,透射电镜检测CCCR-NK92细胞结构学变化;Transwell实验检测CCCR-NK92细胞与NK92细胞效靶实验杀伤方式,CM实验验证CCCR-NK92与NK92细胞在效靶实验中是否存在促凋亡成分的释放,CM-Dil活细胞染色和Hoechst 33342染色检测效靶杀伤效果以及杀伤方式;通过高内涵成像和透射电镜(TEM)观察效靶杀伤方式。建立人肺癌NOG小鼠皮下移植瘤模型,通过石蜡组织切片HE染色,免疫组化以及冰冻组织切片免疫荧光,观察CCCR-NK92细胞抗癌效果。结果1.HE、瑞氏染色和透射电镜实验,慢病毒转染后得到的CCCR-NK92细胞,与NK92细胞相比,细胞器更加丰富,明显可见细胞膜上形成胞质突起。2.CM-Dil和Hoechst 33342双染色法、Transwell实验、条件培养基实验(CM)、高内涵成像分析,CCCR-NK92与H1299接触后发挥杀伤作用;与NK92组相比,CCCR-NK92组凋亡细胞数量增加、存在肿胀破裂且核染色显示荧光强度低于凋亡的细胞。3.透射电镜观察可见,NK92与H1299接触后没有明显变化,CCCR-NK92与H1299接触后向其释放细胞毒性颗粒。4.免疫组化和免疫荧光实验,肿瘤局部存在CD56和PD1阳性的细胞。5.肿瘤切片HE染色,CCCR-NK92组坏死情况高于NK92组和PBS组。结论NK92细胞经嵌合共刺激转换受体改造得到CCCR-NK92细胞,细胞形态结构发生改变,可能与CCCR-NK92细胞通过凋亡和疑似焦亡的途径杀伤靶细胞相关。