论文部分内容阅读
原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）在胚胎和个体发育过程中,经不断分裂发育和分化演变为成体动物器官中的精子和卵细胞。体外分离培养兔PGCs是为胚胎早期发育机理、生殖细胞、细胞疫苗生产、永生化细胞等研究提供大量的细胞。但是,兔PGCs的体外培养方法、传代方法以及建系仍存在许多问题,影响了兔PGCs细胞的应用。兔PGCs体外培养的试验,除可解决这些问题外,也可为大家畜、实验动物的相关研究提供参考。所以建立稳定、高效的增殖传代兔PGCs的方法非常重要。本试验以兔16-20 d的胚胎为研究对象,比较了其胎龄、饲养层种类、饲养层密度、分离方法、传代方法及细胞因子等因素对PGCs分离培养的影响。改善兔PGCs体外分离培养的条件,提高兔PGCs集落数量和质量。为建立稳定的兔PGCs体外分离培养方法提供参考。试验主要结果如下:1.分离培养鼠、兔胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblast,MEF、rabbit embryo fibroblast,REF）。选取昆明白近交系小鼠12-15 d胎鼠和日本大耳白兔16-18 d胎兔为材料,分离MEF、REF,获得生长增殖能力强,纯度高,生物学性状稳定的细胞。将分离得到的MEF、REF按首次换液时间分为6组:分别是12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h换液组,原代细胞首次换液后,每2 d传代一次,根据细胞密度传代培养至P3代;记录0-3代的细胞密度及培养时间。用细胞计数法绘制P1、P3、P8代MEF、REF的生长曲线;比较MEF、REF各代细胞冻存后复苏率,选取冻存30 d、60 d、90 d的P1、P3、P8代进行复苏,并计算复苏率。结果显示:（1）24 h首次换液组P0-P3代细胞培养的总时间与其他换液组比较差异显著（P﹤0.05）。（2）P3代的MEF、REF生长增殖速度快,活性好,形态结构稳定,且纯度高,与P1、P8代比更适合作为饲养层细胞用于后续试验。（3）经30 d、60 d（短时间）冻存的P1、P3代MEF、REF,复苏率较高,复苏后活力好,生物学性状稳定。但由于P1代杂细胞含量较多,复苏后需传2-3代进行纯化,本试验选P3代MEF、REF短时间冻存,用于后续试验。2.饲养层及传代方法对兔PGCs分离培养的影响。本试验选用日本大耳白兔16-20 d胚胎生殖嵴分离PGCs。用RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达,碱性磷酸酶染色等方法进行鉴定。并且从胎龄、分离、传代方法、饲养层密度及种类上对兔PGCs的培养体系优化。得出以下结论:（1）18-20 d兔胚胎生殖嵴形态结构发育完善,能够获得较多的兔PGCs细胞。（2）将分离的兔PGCs,接种到5×104/mL、1×105/mL、5×105/mL密度的MEF、REF饲养层上,兔PGCs在密度为5×105/mL的MEF、REF饲养层上,集落的形成率高且出现时间早,呈典型的桑葚状、鸟巢状聚集生长,保持未分化时间较长,与饲养层细胞之间界限清晰。（3）通过兔PGCs比较在MEF、REF、（MEF、REF按1:2比例制成的）混合饲养层上的生长行为,证明了同源REF饲养层优于混合饲养层,优于异源饲养层MEF。（4）采用胰酶消化法和机械法分离兔PGCs,胰酶消化法比机械法分离得到的原代兔PGCs集落数量更多,在REF饲养层上成功传至P5代,是更适合兔PGCs分离的方法。（5）对比了胰酶消化法、机械法、连同饲养层一起消化法。结果发现,机械法传代最有利于兔PGCs传代培养和集落的形成,传代后的兔PGCs集落形态佳,为理想的兔PGCs传代方法。RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达,碱性磷酸酶染色等方法鉴定的结果呈阳性。3.细胞因子对兔PGCs分离培养的影响。将兔PGCs接种于A、B、C、D四种培养液中,培养液A:基础液+10%FBS+5 ng/mL LIF+2 ng/mL bFGF+1 ng/mL TGF-β1;培养液B:基础液+10%FBS+10 ng/mL LIF+4 ng/mL LIF+4 ng/mL bFGF+2 ng/mL TGF-β1;培养液C:基础液+10%FBS+15 ng/mL LIF+6 ng/mL bFGF+3 ng/mL TGF-β1;培养液D:基础液+10%FBS（对照组）。在培养液中添加细胞因子,可以延长兔PGCs体外存活时间。细胞因子、饲养层两者协同作用能够促进兔PGCs的生长增殖,并保存兔PGCs集落的未分化状态。结果显示,与培养液D（对照组无细胞因子）相比,培养液B中添加LIF、bFGF、TGF-β1三种细胞因子对兔PGCs增殖及保持其未分化时间都有积极影响;本研究中,以REF为饲养层,培养液B为培养液时,培养兔PGCs的效果最佳。