研究目的：自1995年小鼠免疫应答基因1 (Immune responsive gene 1, Irgl)首次被发现以来,在LPM、M.avium ssp. Paratuberculosis (MAP)和促炎症细胞因子刺激诱导的巨噬细胞和树突状细胞(Dendritic cells, DCs)中也证实了Irg1基因的特异性表达或表达升高。同时,发现Irg1基因在妊娠早期特定阶段的子宫内腔内皮细胞中表达迅速上调,以及在弓形虫颅内诱导的小鼠CCR9+神经小胶质细胞中特异性表达。这些结果表明,Irg1基因可能在宿主巨噬细胞介导的抵抗革兰氏阴性菌感染的防御中或感染所致的炎症反应中发挥了重要作用,是一个功能未知的免疫应答基因。值得提出的是,人源IRG1基因的真实表达形式尚未被证实,到目前为止仍处于预测阶段,且其预测序列在近几年内一共经历了4次更新。EST文库分析表明,人源IRG1基因可能在婴儿或成人时期的生殖细胞肿瘤、白血病患者或健康人群的外周血或肺组织中表达。其功能和基因表达的调控机制尚不清楚。另外,胸腺作为T细胞分化、增殖和成熟的主要场所,在胸腺细胞的阳性选择和阴性选择过程中发挥了重要作用,且胸腺内T细胞的分化发育受到胸腺微环境的严谨调控。Th1和Th2细胞是机体内两大主要的CD4+T细胞亚群,分别表达各自不同的细胞因子发挥不同的效应功能,Thl7和Treg两类功能相对的细胞亚群的发现是对获得性免疫系统中效应性CD4+T细胞的一个很好的补充,而Thl7细胞在胸腺内的分化发育机制尚不完全清楚。研究内容：本研究主要检测和证实IRG1基因在人体内的真实表达情况,即在人体发育的何种阶段(胚胎、婴儿、幼儿或成人)、何种状态(生理或病理)、何种组织部位(肝、脾、肺或外周血)、以何种形式(真实表达序列)存在。为了进一步探索IRG1基因在人体中的功能及其表达调控机制,我们制备了人源IRG1蛋白抗原特异性的抗体。另一方面,我们探索了多种刺激条件下成鼠胸腺中效应性T细胞的分化情况。研究方法：我们分别针对不同的人源IRG1基因预测序列,设计了多对基因特异性引物;同时,根据IRG1基因预测序列对应的氨基酸序列作Blast比对分析,选取同源性较高的几个物种,在保守区内设计简并引物,同时,选取了来源于入胚胎的多个器官组织、正常健康成人的外周血和淋巴肿瘤细胞系作为研究对象,并结合LPS刺激条件,RT-PCR检测人体中IRG1基因的真实表达情况。通过分离克隆扩增得到的IRG1基因片段,测序鉴定了其表达的真实性。通过大肠杆菌原核表达系统大量表达重组IRG1 s融合蛋白,以此作为免疫抗原免疫动物,制备抗IRG1蛋白特异性的多克隆抗体。另一方面,我们通过RT-PCR、ELISA和流式细胞术等方法对LPS刺激诱导的胸腺细胞中Th1、Th2、Th17和Treg细胞及其细胞相关的分子表达情况进行了监测和鉴定。研究结果：经过电泳检测和测序分析,我们发现人源IRG1基因在胚胎和LPS刺激的健康成人PBMCs中特异性表达,且在LPS刺激的成人PBMCs中的表达具有时序性。测序分析鉴定了该基因的真实表达,通过构建重组原核表达质粒,以重组IRG1 s融合蛋白连续多次免疫动物制备多克隆抗体,其特异性和效价均满足实验需要。同时,应用该抗体检测了IRG1蛋白在人体组织样本中的表达。另一方面,小鼠胸腺细胞经LPS刺激诱导后出现一群特征性明显的Th17细胞,且这群Th17细胞具有刺激物剂量效应和时间依赖性。虽然Irg1基因在LPS刺激的胸腺细胞中表达,但是与Th17细胞相关分子的表达水平不一致。研究意义：我们首次在人体中检测到了IRG1基因的表达,且克隆到了该基因的部分片段,证实了人源IRG1基因的真实存在,并为下一步获得全长cDNA序列奠定了基础。同时,抗人源IRG1蛋白的多克隆抗体的制备也为进一步探索IRG1基因在人体中的功能及其表达调控机制提供了一个有力的研究工具。LPS刺激诱导的小鼠胸腺中Th17细胞分化,说明了胸腺可以作为Th17细胞分化的场所,且成年小鼠的胸腺中可能存在一群有活性的Th17前体细胞,经LPS刺激后能诱导向Th17细胞分化。Th17细胞分化的剂量效应和时间依赖性表明这群细胞可能在宿主抵抗严重的革兰氏阴性菌感染过程中发挥了重要作用,也为研究Th17细胞的分化发育机制提供了前提。另外,Irg1基因作为抗感染免疫应答过程中的一个重要调控分子,并不参与调节LPS刺激诱导的胸腺Th17细胞的分化。