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单核细胞侵袭血管内皮层进入人内膜最终形成泡沫细胞是动脉粥样硬化病变形成早期事件之一。该过程涉及多种糖蛋白参与，但其机制尚不清楚。本项目以血管内皮细胞为研究对象，以α2,6-唾液酸转移酶1（ST6GAL1）是否通过催化 VE-Cadherin唾液酸化发挥其在细胞间紧密连接的作用，而BACE1蛋白降解途径对ST6Gal-1可能起调控作用为研究核心，探讨细胞粘联的分子机制，寻找炎症诱发动脉粥样硬化的分子基础。通过建立 BACE1基因过表达转染模型，采用western blot、SNA/MAA blot、免疫共沉淀技术、流式细胞术和激光共聚焦显微镜等技术,检测 TNF-α诱导前后细胞中唾液酸化和粘附功能的差异，及对PKC信号级联系统的影响。以期回答糖基转移酶是如何影响动脉硬化形成这一科学问题，为相关疾病的防治提供新的思路。本研究分为三个部分： 第一部分：炎症损伤模型的建立。 目的：以内皮细胞EA.hy926及RAEC细胞为研究对象，建立炎症损伤内皮细胞模型，采用分子生物学的技术手段，分析不同内皮细胞在炎症因子的作用下内皮细胞超显微结构和单核-内皮粘附功能的变化，为实验模型建立奠定基础。 方法：⑴采用免疫荧光的方法，验证EA.hy926细胞和RAEC细胞是否具有内皮细胞特性。⑵采用CCK8法，验证TNF-α对内皮细胞活力的影响。⑶采用倒置显微镜，观察TNF-α对内皮细胞的影响。⑷采用细胞粘附实验，验证TNF-α对单核-内皮粘附功能的影响。⑸采用透射电镜，观察TNF-α对内皮细胞超显微结构的影响。 结果：①形态学结果表明，EA.hy926细胞和RAEC细胞具有内皮细胞特异性。②CCK8实验及倒置显微镜结果显示，TNF-α浓度在0-50ng/ml时，时间在0-24h时，不会显著地抑制EA.hy926细胞存活率。TNF-α浓度在0-20ng/ml时，时间在0-24h时，不会显著地抑制RAEC细胞存活率。③粘附实验结果证实，TNF-α在0-50ng/ml范围内，能诱导EA.hy926细胞与THP-1细胞的粘附能力显著上升；TNF-α在0-20ng/ml范围内，能诱导RAEC细胞与THP-1细胞的粘附能力显著上升。④电镜结果表明，与对照组相比，TNF-α能破坏EA.hy926细胞的紧密连接。 结论：⑴EA.hy926细胞和RAEC细胞具有内皮细胞特异性。⑵炎症因子刺激下，单核-内皮细胞粘附功能上调。⑶炎症因子刺激后，影响内皮细胞之间的紧密连接。 第二部分：TNF-α通过上调BACE1表达，诱导内皮细胞中VE-Cadherin唾液酸下调，从而破坏内皮细胞的紧密连接及上调单核-内皮的粘附能力。 目的：探讨在炎症条件下 BACE1的上调是否通过降解 ST6GAL1影响VE-Cadherin唾液酸化修饰。分析BACE1水解 ST6GAL1对内皮细胞紧密连接和单核-内皮粘附功能的影响。 方法：⑴采用流式细胞术，验证TNF-α对内皮细胞唾液酸化的影响。⑵采用western blot和激光共聚焦显微镜，验证炎症时 BACE1水解ST6GAL1下调内皮细胞的唾液酸化。⑶采用免疫共沉淀技术，验证VE-cadherin时炎症诱导内皮细胞唾液酸化下调的靶蛋白。⑷采用BACE1抑制剂（β-secretase inhibitor IV），验证BACE1抑制剂对炎症条件下BACE1水解ST6GAL1对内皮细胞唾液酸化的影响及对单核-内皮细胞粘附功能和内皮细胞超显微结构的影响。⑸构建BACE1过表达模型，验证BACE1水解ST6GAL1调控内皮细胞唾液酸化的相关机制，并检测其对单核-内皮粘附功能和内皮细胞超显微结构的影响。 结果：①TNF-α刺激24h后，与对照组相比，FITC-SNA标记的平均荧光强度值显著下调，说明TNF-α诱导了EA.hy926和RAEC细胞的α2,6-唾液酸水平下调。而FITC-MAL标记的平均荧光强度值未见统计学意义的变化，说明TNF-α不能显著改变RAEC细胞的α2,3-唾液酸水平。②Western blot结果显示，与对照组比较，TNF-α诱导BACE1蛋白表达水平上调，同时ST6GAL1及总蛋白α2,6-唾液酸水平的表达水平下调。免疫荧光实验表明，正常的内皮细胞的表面存在α2,6-唾液酸修饰，而TNF-α诱导后，内皮细胞的α2,6-唾液酸修饰水平降低。③IP实验显示，与对照组相比，TNF-α诱导后 VE-Cadherin的唾液酸化水平显著降低。④Western blot和免疫荧光实验表明，BACE1抑制剂能拮抗TNF-α诱导的BACE1上调及BACE1降解ST6GAL1及下调内皮细胞的唾液酸化。细胞粘附实验显示，BACE1抑制剂能拮抗TNF-α诱导的单核-内皮粘附能力的升高。透射电镜结果显示，BACE1抑制剂能拮抗 TNF-α破坏内皮细胞之间的紧密连接。⑤过表达BACE1基因后，Western blot和免疫荧光实验表明，ST6GAL1和内皮细胞唾液酸化的表达下调。细胞粘附实验显示，过表达BACE1基因后，单核-内皮的粘附能力升高。透射电镜结果显示，过表达BACE1破坏内皮细胞之间的紧密连接。 结论：⑴TNF-α诱导内皮细胞唾液酸水平的下调。⑵TNF-α诱导BACE1降解 ST6GAL1下调VE-Cadherin的唾液酸化，从而提高单核-内皮细胞的粘附功能及破坏内皮细胞的紧密连接。⑶BACE1抑制剂通过拮抗BACE1水解ST6GAL1的相关机制，从而影响单核-内皮的粘附能力及内皮细胞的紧密连接。⑷BACE1基因过表达后，BACE1水解 ST6GAL1，通过下调靶蛋白VE-Cadherin的唾液酸化降低了内皮细胞的唾液酸化，从而影响单核-内皮的粘附能力及内皮细胞的紧密连接。 第三部分：TNF-α上调BACE1表达的相关机制。 目的：探讨TNF-α通过PKC/MEK/ERK信号通路上调BACE1的表达。 方法：⑴采用western blot，验证TNF-α通过激活PKC的磷酸化上调BACE1的表达。⑵采用western blot，验证PKC/MEK/ERK信号级联系统之间的关系，并验证TNF-α通过激活PKC/MEK/ERK信号级联系统上调BACE1的表达。⑶采用粘附实验，验证炎症条件下 PKC信号通路对单核-内皮粘附功能的影响。 结果：①与对照组相比，PKC的磷酸化水平显著升高。②与对照组相比，PKC的激活剂上调了BACE1的表达(P<0.05)，PKC的抑制剂拮抗了BACE1的上调(P<0.05)。③与TNF-α组相比，PKC抑制剂组的MEK磷酸化水平显著降低(P＜0.05)，ERK抑制剂组的MEK磷酸化水平没有显著的变化(P＞0.05)（。图3.3A、B）与TNF-α组相比，PKC抑制剂组的ERK磷酸化水平显著降低(P＜0.05)，ERK抑制剂组的ERK磷酸化水平显著降低(P＜0.05)。（图3.3C、D）与TNF-α相比，PKC的抑制剂或ERK的抑制处理后，BACE1的表达水平显著下调(P＜0.05)。这一结果表明 TNF-α通过激活PKC/MEK/ERK信号级联系统上调BACE1的表达。④与 TNF-α组相比，PMA处理后单核-内皮的粘附能力显著升高(P＜0.05)。PKC的抑制剂处理后单核-内皮的粘附能力显著降低(P＜0.05)。这一结果表明TNF-α可能通过PKC信号通路影响单核-内皮之间的粘附作用。 结论：TNF-α通过激活PKC/MEK/ERK信号级联系统上调BACE1的表达及影响单核-内皮的粘附功能。