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目的:坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是严重威胁早产极低出生体重儿(very low birth weight infant,VLBWI)生命的炎症性肠道疾病,至今其病因及发病机制尚未完全明确,肠道菌群失衡被认为在NEC发生、发展中起重要作用。本研究旨在通过高通量测序技术对早产儿粪便样本16SrDNA基因进行测序,探讨肠道菌群对早产VLBWI NEC发生、发展的影响,为NEC的预防及治疗提供可靠依据。方法:将2018年04月20日至2018年11月20日期间于生后24小时内收住苏州大学附属儿童医院新生儿重症监护病房(Neonatal intensive care unit,NICU)和/或苏州市立医院本部母子中心NICU且出生体重<1500g的早产儿作为研究对象,采用前瞻性巢式病例对照研究(Nested Case-Control study,NCC)的方法,采集所有早产儿基本临床资料,粪便样本于生后一周内留取第1、4、7天的样本,之后每周留取一次,留取粪便标本的终点为NEC发生、出院时或生后第8周(哪个先到则以此为终点),将研究对象分成NEC组和VLBW control组两组:根据NEC诊断标准将发展为NEC的研究对象作为NEC组,VLBW control组从未发生NEC的早产儿中按1:1的比例进行随机匹配。根据修正Bell分期标准将NEC组分为NEC Ⅰ、NEC Ⅱ、NEC Ⅲ期三亚组。抽取已采集好的NEC组与VLBW control组的临床信息和粪便样本,基于16SrDNA高通量测序的方法,分析NEC组、VLBW control组及不同NEC亚组的临床资料及肠道菌群情况。结果:一、临床基本资料信息:纳入队列中的早产儿数总共184例,队列中有39例早产儿发生NEC,其中NEC Ⅰ期16例,NEC Ⅱ期16例,NEC Ⅲ期7例,NEC的发病日龄为4～53天,平均16(10,23)天;队列中未发生NEC的早产儿共145例,按1:1的比例与NEC组随机匹配为VLBW control组(39例)。两组性别分布、出生体重、胎龄、入院时龄、分娩方式、是否自然受孕、是否多胎、是否小于胎龄、有无窒息、母亲基本信息等一般情况无明显差异(P>0.05);NEC组早产儿败血症、感染性肺炎、呼吸衰竭、肠外营养相关性胆汁淤积症(parenteral nutrition associated cholestasis,PNAC)的发生率较VLBW control组明显升高,NEC组发病前加奶速度快,抗生素使用时间长,二联及以上特殊级抗生素使用、输血≥3次、有创呼吸机、持续气道正压通气呼吸机(continuous positive airway pressure,CPAP)等治疗措施使用率较VLBW control组明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05);NEC组死亡人数较VLBW control组明显增多(P=0.012)、达到全肠内营养时间和住院时间延长,住院花费增高,差异均显著(P>0.05)。二、粪便16SrDNA高通量测序结果:(1)物种相对丰度分析显示,在门分类水平上,厚壁菌门(Firmicutes)在NEC组和VLBW control组中有一过性下降,在NEC组中于生后第14天最低,在VLBW control组中提前至生后7天,且NEC组厚壁菌门相对丰度从生后第14天开始较对照组偏低,而变形菌门(Proteobacteria)相对丰富。(2)Alpha多样性分析结果:①VLBW control组与NEC组chao1指数、observed species指数均显示第7天时有一过性下降,后随日龄增长而上升,自出生7天后,NEC组chao1指数和observed species指数相对VLBW control组偏低,但无统计学意义(P>0.05);VLBW control组shannon指数、simpson指数在第7天有一过性下降,后随日龄增大而上升,而NEC组无此规律,NEC组自出生7天之后菌群shannon指数、simpson指数较VLBW control组偏低,在第21天、第28天时差异有统计学意义(P<0.05);②NEC 不同亚组:三组之间 observed species 指数不同(P=0.013),NEC Ⅰ期与NEC Ⅱ期之间observed species指数差异显著(P=0.002),NEC Ⅰ期与NEC Ⅲ期之间、NEC Ⅱ期与NEC Ⅲ期之间未见明显差异;NEC Ⅱ期较NEC Ⅰ期shannon指数增高,差异有统计学意义(P=0.049),但NEC Ⅰ期与NEC Ⅲ期、NEC Ⅱ期与NEC Ⅲ期之间无明显差异(P>0.05)。(3)Beta多样性分析结果:从生后21天、28天,NEC组与对照组之间差异突出,同组样本聚集在一起。(4)菌群群落结构差异显著性分析结果:①与VLBW control组相比,NEC组从生后第4天开始已有差异菌群,在纲水平上,NEC组Erysipelotrichi减少显著(P=0.006);从生后第14天开始拟杆菌门(Bacteroidetes)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)显著增多(P=0.005;P=0.01);生后第21天,厚壁菌门、梭菌纲(Clostridia)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)显著减少(P=0.003;P=0.03;P=0.04);生后第28天,厚壁菌门、梭菌纲(Clostridia)、梭菌科(Clostridiaceae)减少更加显著(P=0.006;P=0.001;P=0.001)。②NEC 不同亚组之间:NEC Ⅱ期和Ⅲ期中红蝽菌纲(Coriobacteriia)、Coriobacteriaceae科均较NEC Ⅰ期显著增多(P=0.0001;P=0.002);与NEC Ⅱ期相比,NEC Ⅲ期长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、殊异韦荣菌(veillonella dispar)显著减少(P=0.003;P=0.032)。结论:(1)发展为NEC的VLBWI败血症、感染性肺炎、呼吸衰竭、PNAC发生率高,抗生素使用时间长,二联及以上特殊级抗生素使用、输血≥3次、有创呼吸机、CPAP等治疗措施使用率高,达到全肠内营养时间、住院时间延长,住院花费增高。(2)NEC组和VLBW control组的肠道菌群定植模式均表现为厚壁菌门一过性下降,在NEC组中于生后第14天最低,而VLBW control组则提前至生后7天。(3)发展为NEC的VLBWI从生后第21天开始肠道菌群多样性即明显下降,而NEC不同Bell分期间未发现随病情加重肠道菌群多样性明显减低情况。(4)发展成NEC的早产儿从生后第4天开始即有差异菌群,随日龄增长,差异菌群有所变化。(5)NEC不同Bell分期间各有差异菌群,Coriobacteriaceae科、红蝽菌纲的增高与重度NEC相关。