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禽白血病病毒(Avianleukosisvirus,ALV)属于反转录病毒科禽C型反转录病毒属,与禽类多种肿瘤性疾病及生产性能息息相关。该病毒主要引起禽类产生肿瘤以及慢性消耗性死亡,造成免疫抑制及生长迟缓,产蛋率大幅度下降,给养禽业带来巨大损失。ALV通过垂直和水平两种方式传播,限制本病的主要方法是淘汰阳性鸡,净化种群中的ALV-A、B、C、D、J和K等亚群。不同亚群病毒有不同的生物学特性以及临床症状,临床上选择合适的试剂盒是净化该病毒的关键。本研究通过研制针对A亚群禽白血病病毒gp85的单克隆抗体,并分析不同试剂盒检测禽白血病的差异性,为生产实践中禽白血病的净化提供研究基础。1 抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备与鉴定Gp85是ALV的囊膜蛋白,由ALV基因组中env基因编码,具有亚群特异性。本研究首先设计出一对针对A亚群禽白血病病毒env基因的特异性引物,PCR扩增本实验室分离保存的ALV-A-AH10毒株的gp85基因,然后构建原核表达载体PET32a-AH10-gp85,通过转化入BL21感受态细胞,筛选阳性转化质粒并经IPTG诱导表达,对表达的菌体进行超声波破碎,取离心后的上清和沉淀分别作SDS-PAGE分析,结果获得大小约53KD的目的蛋白。纯化后的PET32a-AH10-gp85蛋白与适量佐剂乳化后免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠,三次免疫后测小鼠血清抗体效价,对免疫效果较好的加强免疫,三天后取脾脏与骨髓瘤细胞进行融合。用感染AH10病毒的DF1细胞板,固定后,对融合成功的杂交瘤细胞进行IFA筛选。阳性孔经过2-3次亚克隆,结果获得五株稳定分泌单克隆抗体,分别命名为ALV-A-1B12、ALV-A-1C12、ALV-A-1E5、ALV-A-1F8 和 ALV-A-3D11。Western-blot 和 IFA试验结果表明,所获单抗3D11只针对ALV-A/B囊膜蛋白gp85抗原,而其余四株可与J亚群病毒发生荧光反应。本次研究成功制备出一株针对ALV-A/B的单克隆抗体(3D11),为快速筛检田间感染A/B亚群禽白血病病毒的鸡群提供了临床诊断试剂。2不同试剂盒检测禽白血病肛拭阳性率的差异性分析建立快捷准确,成本低,可用于大批量田间试验的诊断技术是防制禽白血病的重要一环。ELISA检测方法因其具有灵敏、快捷、适用于大面积检测等特点,在众多方法中脱颖而出,被广泛应用于禽白血病的种群净化中。为探索不同ELISA试剂盒针对禽白血病p27抗原检测灵敏度的差异性,本研究将60只2周龄黄羽雏鸡(包括30只活鸡、30只死鸡)进行编号并采集肛拭、血样及组织样本。分别用IDEXX公司p27抗原检测试剂盒和sELISA试剂盒检测其肛拭样本。血样及组织样本接种DF1细胞分离病毒,7天后取培养上清进行p27抗原检测及鉴定,分析比较肛拭阳性率差异,并通过PCR、RT-PCR及间接免疫荧光法验证。结果显示,sELISA试剂盒肛拭阳性检出率为68%,IDEXX试剂盒阳性检出率为27%,且IDEXX公司阳性检出样本均存在于sELISA试剂盒阳性检出的样本中。阳性差异样本通过测序分析,进一步确认为感染K亚群禽白血病病毒,这一结果显示,sELISA试剂盒能够更灵敏有效地检测阳性肛拭样本,特别是检测肛拭中的禽白血病K亚群病毒。