目的:脓毒症(sepsis)是因感染或感染因素而导致的宿主反应失调所引起的危及生命的器官功能障碍综合征[1]。脓毒症是涉及感染、炎症、免疫、凝血及组织损害等一系列临床问题的综合症,尽管如今医疗技术逐步提升,该症死亡率仍居高不下。据不完全统计,全球每年受脓毒症影响的患者达到3150万,而严重脓毒症病例1940万,约造成全球每年530万人死亡[2,3],是临床急危重症患者死亡的主要原因。脓毒症的病理生理过程首先是感染或感染因素引发机体的免疫失调,以过度炎症反应为初始免疫反应,即进入炎症风暴(cytokine storm)即全身炎症反应综合征(systemic Inflammatory response syndrome,SIRS)阶段;因持续的免疫失调,机体随即进入脓毒症免疫抑制阶段,患者会因继发感染和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),这与脓毒症患者后期的免疫抑制、机体对致病菌的二次打击(second hit)抵抗力减弱密切相关。因此,脓毒症患者死亡高峰期有两个,一个是炎症风暴期,大约30%的患者于该阶段死亡;另一个即免疫抑制期,大约70%的患者会因继发感染和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)于该阶段死亡[4,5]。关于脓毒症免疫抑制发生的时间点及其病理生理特点,目前学术界存在两种不同的观点:一种认为脓毒症免疫抑制状态的本质是代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-Inflammatory response syndrome,CARS),是随着SIRS出现而出现,该阶段的特点是抗炎细胞因子水平显著降低,而抗炎细胞因子如IL-10、TGF-β及IL-4等过度产生[6];另一种观点则认为免疫抑制状态是在机体完全度过炎症风暴后出现,其特点是致炎和抗炎细胞因子整体水平的降低[7,8]。由于针对SIRS开展的脓毒症免疫治疗药物研究并没有达到降低患者死亡率的目标。目前,研究者们致力于以改善免疫抑制状态为目的的免疫调节药物的研究[9],希望治疗脓毒症的药物应同时具有抗炎和逆转免疫抑制的双向调节作用。脓毒症免疫抑制病理生理机制和治疗药物进行研究的基础是有一个可反映临床脓毒症免疫抑制病理生理特征的动物模型。目前学术界认可的脓毒症免疫抑制模型主要包括:内毒素耐受模型和盲肠结扎穿孔术(cecal ligation andpuncture,CLP)。本课题组前期已经成功建立小鼠内毒素耐受模型,但鉴于该模型尚不能完全反映临床脓毒症免疫抑制状态的病理生理特征,为此在本研究中首先着力于CLP脓毒症免疫抑制模型的建立。CLP脓毒症模型目前被认为是进行脓毒症研究动物模型的“金标准”[10],更接近于临床实际。但国内外关于CLP脓毒症免疫抑制转折点的报道各不相同,我们按照文献进行免疫抑制转折点的研究未获成功。因此,本研究首先基于CLP脓毒症模型进行脓毒症免疫抑制模型的建立,然后将铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)作为二次打击病原体建立CLP脓毒症免疫抑制二次打击模型,对脓毒症免疫抑制模型进行系统研究,为进一步研究脓毒症免疫抑制的病理生理过程、评价治疗脓毒症的药物尤其是治疗脓毒症免疫抑制的药物奠定基础。抗疟药青蒿琥酯(artesunate,AS)是含有倍半萜结构的青蒿素衍生物,该药广泛应用于疟疾的治疗,长期的临床应用已显示其具有毒性低、安全性好的特点。我们课题组在前期中发现,青蒿琥酯对CLP及不同细菌(大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等)造成的脓毒症模型小鼠均显示出显著的治疗作用;对LPS耐受模型的脓毒症免疫抑制小鼠模型也具有显著疗效,能提高LPS耐受小鼠受二次打击的生存率,升高体内炎症相关细胞因子的释放并增强免疫抑制小鼠细菌清除能力。因此,本课题拟在建立CLP脓毒症免疫抑制动物模型的基础上,观察青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠的治疗作用;并在建立内毒素耐受细胞模型的基础上,观察青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠治疗作用的可能机制,为寻找有效治疗脓毒症的药物并拓宽青蒿琥酯的临床适应症提供实验依据。方法:一、CLP脓毒症免疫抑制小鼠模型的建立与评价1.小鼠CLP模型术式的选择:通过观察小鼠的7天死亡率,筛选出可导致40%CLP小鼠死亡的术式。2.CLP脓毒症免疫抑制转折点的确定:复制40%死亡率的CLP模型小鼠,并于术后不同时相点(0.5、1、2、3、4、5、6、7天),尾静脉注射PA(2.5×107 CFU/10g),通过观察小鼠的7天死亡率确定脓毒症免疫抑制转折点,完成CLP脓毒症免疫抑制小鼠模型的建立。3.CLP脓毒症免疫抑制小鼠对不同剂量细菌的敏感性观察:在CLP组及假手术(Sham)组小鼠术后1天(24 h),给予尾静脉注射7个剂量的铜绿假单胞菌(PA,2.5×108、5×107、2.5×107、5×106、1×106、5×105、1×104 CFU/10g,给菌体积为0.1 m L/10 g体重),观察和记录小鼠7天死亡率。4.CLP脓毒症免疫抑制小鼠炎症相关细胞因子水平的检测:ELISA法检测各组(NS组、Sham组、CLP组、Sham+PA组、CLP+PA组)血清、脾脏及肺脏中炎症相关细胞因子浓度。5.CLP术后小鼠炎症相关细胞因子水平动态变化情况的检测:ELISA法检测CLP术后各组时相点炎症相关细胞因子的变化情况:Sham组术后(0、2、8、12、24 h),CLP组术后(0、2、4、8、12、24、48、72 h),Sham+PA组(给菌后4、24、48 h),CLP+PA组给菌后(4、24 h)。6.CLP脓毒症免疫抑制小鼠静脉血细胞数量的检测:小鼠CLP术后1天(24 h)尾静脉注射PA,并于4 h后经眼底静脉丛取血、抗凝管收集后立即通过小动物血液分析仪对各组小鼠静脉血五种白细胞(中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)的绝对值及百分比进行检测。7.CLP脓毒症免疫抑制小鼠细菌清除能力的观察:小鼠CLP术后1天(24 h)尾静脉注射PA,并于4 h后取材,采用平板计数法观察小鼠(NS组、Sham组、CLP组、Sham+PA组、CLP+PA组)血液、脾脏及肺脏中细菌量确定各组小鼠对细菌清除能力。二、青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠的治疗作用1.观察青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠接受PA二次打击后7天死亡率的影响。2.观察青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠及CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠接受PA二次打击后细胞因子的影响:采用ELISA法检测青蒿琥酯对小鼠体内致炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β及抗炎细胞因子IL-4、IL-10、TGF-β水平的影响3.青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠及CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠接受PA二次打击后血细胞的影响:通过小动物血液分析仪,对小鼠静脉血中白细胞及五种亚型(中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)的绝对值及百分比进行检测。4.青蒿琥酯CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠接受PA二次打击后细菌清除能力的观察:采用平板计数法观察青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠接受PA二次打击后血液、肺脏和脾脏中细菌数量变化的影响。三、青蒿琥酯对脓毒症免疫抑制模型小鼠治疗作用分子机制的初步研究1.体外实验(1)免疫抑制细胞模型的建立与评价:建立内毒素/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)耐受细胞模型(RAW264.7细胞),并将该细胞模型作为脓毒症免疫抑制的体外模型开展研究;根据LPS与TNF-α释放的量效、时效关系的结果确定LPS耐受细胞模型刺激用LPS浓度及取材时间;ELISA法检测细胞TNF-α的释放水平、WB法检测细胞总蛋白中炎症信号转导通路TLR4、My D88蛋白的表达情况,以此评价细胞模型。(2)青蒿琥酯对LPS耐受细胞释放TNF-α的影响:ELISA法检测LPS耐受细胞及青蒿琥酯给药组细胞TNF-α的释放水平。(3)青蒿琥酯对LPS耐受细胞炎症及自噬相关关键分子的影响:WB法检测细胞总蛋白中TLR4信号转导通路中重要分子及自噬相关关键分子TLR4、BECN1的表达情况。2.体内实验青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制小鼠及CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠接受PA二次打击后体内TLR4信号转导通路中重要分子及自噬相关关键分子的影响:采用免疫组织化学技术和WB两种方法法检测小鼠肺脏和脾脏中中重要分子及自噬相关关键分子TLR4、My D88、TRAF6、BECN1蛋白表达及NF-κBp65的活化情况。结果:一、CLP脓毒症免疫抑制小鼠模型的建立与评价1.小鼠CLP模型的术式选择:小鼠死亡率因不同的结扎距离、不同直径穿刺针及不同数目肠穿孔而不同,我们成功建立了7天内动物死亡率分别为0、10.0%、36.3%、45.4%的四种CLP模型。选择了45.4%死亡率的CLP 4组作为脓毒症模型术式(距离盲肠盲端1.0 cm处结扎,16号钢针穿刺1孔)2.CLP脓毒症免疫抑制转折点的确定:CLP手术后1天(24 h)给予PA的小鼠7天死亡率显著高于CLP组(p<0.05);而CLP 2天至7天给予PA均未显示出二者显著差异。因此,CLP脓毒症免疫抑制小鼠免疫抑制转折点初步可能为CLP手术后1天(24 h)。3.不同剂量细菌对CLP术后1天小鼠造成不同的死亡率:CLP术后1天(24 h)小鼠与Sham组小鼠比较,其对不同剂量的细菌攻击敏感性更高,初步认为该时相点为免疫抑制转折点。4.CLP脓毒症免疫抑制小鼠受到PA攻击后,体内的致炎细胞因子水平(血清、脾脏及肺脏中TNF-α、IL-6和IL-1β)及抗炎细胞因子水平(肺脏IL-4、IL-10、TGF-β)均未显著升高,炎症相关细胞因子释放情况呈全面抑制状态,符合脓毒症免疫抑制的病理生理特点。5.CLP术后炎症相关细胞因子动态变化情况的检测:致炎细胞因子及抗炎细胞因子均呈现了先升高后降低的趋势;给菌后4 h的致炎细胞因子及抗炎细胞因子结果均再次显示CLP+PA组的水平明显比Sham+PA组低。6.CLP脓毒症免疫抑制小鼠静脉血细胞中白细胞数量显著降低,其白细胞五种分型百分比也有明显变化。7.CLP脓毒症免疫抑制小鼠细菌清除能力的观察:平板计数结果显示NS组、Sham组、CLP组血液、脾脏和肺脏中均无PA菌落检出;而Sham+PA组血液、脾脏和肺脏中PA菌落均显著少于CLP+PA组,显示Sham组对细菌清除能力显著强于CLP术后1天(24 h),再次显示CLP术后1天(24 h)小鼠处于免疫抑制状态。二、青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠的治疗作用1.青蒿琥酯能显著降低CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠接受PA二次打击后的7天死亡率。2.青蒿琥酯能显著增加CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠及接受PA二次打击后血清、脾脏和肺脏致炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平;降低肺脏中抗炎细胞因子IL-4、IL-10、TGF-β水平。3.青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制小鼠及CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠接受PA二次打击后静脉血中白细胞绝对值及五种分型的绝对值及百分比的影响较小。4.青蒿琥酯能显著减少CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠接受PA二次打击后血液、肺脏和脾脏中细菌数量。三、青蒿琥酯对脓毒症免疫抑制模型的治疗作用机制的初步研究1.体外实验(1)采用将0.01 ng/m L LPS预处理RAW264.7细胞4 h的方法建立LPS耐受细胞模型,再给予10 ng/m L LPS处理该细胞,结果显示细胞释放TNF-α的水平并无显著上升,表明采用该方法可建立体外LPS耐受模型;WB结果提示,该模型细胞TLR4、My D88表达水平较低,进一步表明该方法可成功建立体外LPS耐受细胞模型。(2)青蒿琥酯(20μg/m L)可显著提高LPS耐受细胞模型释放TNF-α的能力。(3)WB结果提示,在LPS耐受细胞模型中,青蒿琥酯(20μg/m L)可增加该模型细胞TLR4信号转导通路中重要分子TLR4及自噬相关关键分子BECN1的表达。2.体内实验(1)在CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠及CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠接受PA二次打击模型中,免疫组织化实验结果显示青蒿琥酯(10 mg/kg)能增加免疫抑制模型小鼠肺脏和脾脏中TLR4信号转导通路及自噬相关重要分子TLR4、TRAF6、BECN1蛋白表达及NF-κBp65蛋白亚基的活化水平。(2)WB实验结果显示,青蒿琥酯(10 mg/kg)能增加CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠肺脏中TLR4、My D88、TRAF6、LC3蛋白的表达,增加NF-κBp65亚基的活化水平;青蒿琥酯能增加CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠接受PA二次打击后肺脏中TLR4、My D88、BECN1蛋白的表达,增加NF-κBp65蛋白亚基的活化水平。结论:1.建立约40%死亡率的CLP脓毒症模型,CLP术后24 h时相点为脓毒症免疫抑制转折点;该模型稳定性好、重复性高,且造模周期短;2.青蒿琥酯可显著增加CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠致炎细胞因子TNF-α、IL-6IL-1β及抗炎细胞因子IL-10、IL-4、TGF-β的释放水平;3.青蒿琥酯可显著降低CLP脓毒症免疫抑制状态小鼠接受PA二次打击后的7天死亡率,表明其对脓毒症免疫抑制小鼠模型具有很好的治疗作用,并显著提高CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠对铜绿假单胞菌的清除能力;4.青蒿琥酯对脓毒症免疫抑制小鼠的治疗作用机制可能与其增加LR4信号转导通路及自噬相关关键分子TLR4、My D88、TRAF6、BECN1、LC3的蛋白表达及NF-кB p65活化有关。