急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是严重危害人类健康的疾病之一，虽然最近ARDS的死亡率有所降低，但仍然是临床治疗的一个难点。局部或全身性损害都可造成肺弥漫性损伤而导致ARDS，肺损伤可能是由于肺实质直接损伤造成的，也可能是由于急性炎症反应激活后释放的大量炎症介质引起的失控性炎症反应造成的。目前尚不清楚导致失控性炎症反应激活的最直接信号，但是研究发现，多种Gq蛋白偶联受体(例如TXA2、PAF和ET等受体)参与了急性肺损伤的发病过程，这些Gq偶联受体具有促进血小板凝集、支气管痉挛、血管内微血栓形成以及中性粒细胞趋化等多种生物学效应，在急性肺损伤的过程中具有重要的作用。单独采用其中某一种受体阻断剂都可以部分减轻急性肺损伤肺水肿的程度，改善动脉血气。当然，还有很多已知和未知的细胞因子参与了ARDS发病机制，但到底那一种细胞因子的作用最重要？这一问题可能很难回答。尽管细胞因子及趋化因子的数目众多，但是其信号转导通路的数目相对较少，G蛋白信号转导途径就是众多细胞因子和趋化因子发挥作用的重要信号转导途径之一。Gq 偶联受体参与了急性肺损伤的病理生理过程，因此Gq和其信号转导的调节可能在急性肺损伤的发病机制中具有重要作用。近年发现的G蛋白信号转导调节因子(Regulators of G-protein signaling)是细胞内GTP酶(GTPase)激活蛋白(GTPase activating proteins，GAPs)，它可加速Giα和Gqα水解GTP，从而限制Gq和Gi蛋白激活的强度和持续时间，调节信号转导过程。在正常情况下，生物体内的RGS对G蛋白信号转导系统进行精密调节，可使G蛋白信号转导系统对刺激信号作出一定强度和一定持续时间的反应。如果RGS出现异常，对G蛋白信号转导的调节就可能出现异常，从而引起G蛋白信号转导的改变而造成组织损害。本课题首先合成Gq反义寡核苷酸，采用western blot和RT-PCR的方法，离体观察其对ECV304细胞Gq蛋白和mRNA表达的抑制作用，采用放射性配基结合方法检测IP3含量的变化，观察其对Gq蛋白信号转导的阻断作用；进一步采用油酸致小鼠ARDS模型，在体实验观察Gq反义寡核苷酸的治疗作用，然后通过其内源性活性调节因素RGS的变化探讨Gq及其调节机制在ARDS发病机制中的作用和机制。<WP=9>主要研究内容和结果：1．ECV304细胞培养实验发现，硫代修饰合成的Gqα反义寡核苷酸可以有效抑制Gqα蛋白和mRNA的表达，这种抑制作用呈剂量依赖性，在0.1uM到10.0uM的范围内，随着剂量的增加，抑制作用增强，在24小时、48和72小时时相点内，随着时间的延长，抑制作用增强。Gqα反义寡核苷酸对Gs和Gi的mRNA表达没有影响。2．放射性配基结合检测IP3含量发现，U46619刺激后，ECV304细胞产生IP3显著增加。Gqα反义寡核苷酸处理后24、48和72小时，Gqα反义寡核苷酸都可以有效抑制基础状态和U46619刺激后ECV304细胞IP3的产生。在0.1uM到10.uM的范围内，这种抑制作用呈剂量依赖性增强。上述结果提示，合成的反义寡核苷酸可以通过抑制Gqα的表达阻断Gqα介导的信号转导。3．预先用Gqα反义寡核苷酸处理后，可以改善油酸致伤后6小时、24小时的肺水肿和肺动脉血气。油酸致急性肺损伤后6小时和24小时， Gqα蛋白表达显著下调，但肺组织内IP3含量显著升高，提示Gqα表达下调可能是急性肺损伤时机体的保护性下调，但此时IP3含量仍高于正常，提示急性肺损伤时Gqα活性显著增强。Gqα反义寡核苷酸预处理可以进一步降低Gqα的表达水平，从而减弱Gqα的活性，降低肺组织内IP3的含量。因此，Gqα反义寡核苷酸可以通过阻断Gq蛋白偶联受体的信号转导减轻肺组织损伤。4．油酸致急性肺损伤后，肺组织内RGS2和RGS4蛋白具有相同的变化趋势，6小时升高，24小时达到峰值，48小时已经开始恢复，但仍未达到正常水平。地塞米松处理后RGS2、和RGS4蛋白和mRNA 6小时、24小时和48小时均低于油酸致伤组，但高于对照组。提示急性肺损伤时Gqα活性增强可导致RGS2、RGS4表达增加。5、RGS4表达载体转染ECV304细胞后，正常氧分压培养的情况下，内皮细胞的凋亡没有变化，地塞米松处理对凋亡也没有影响。但是在低氧(1％O2/%5CO2/94%N2)条件下，RGS4表达载体转染后可使ECV304细胞凋亡显著增加，地塞米松对RGS4诱导的细胞凋亡有抑制作用。地塞米松的这种抑制细胞凋亡的效应可能与其通过“非基因组机制”激活内皮细胞一氧化氮合酶活性有关。