研究背景皮肤作为人体最大的器官,对于维持并延续人的生命有着重要作用。作为机体对外防御的第一道屏障,皮肤具有保护人体免受物理、化学伤害的作用,同时防止细菌等微生物的入侵并维持体液和电解质的平衡。生活中的烧伤、创伤等多种致伤因素均可导致皮肤结构和功能的破坏,尤其对于大面积皮肤缺损的患者例如严重烧伤病人而言,由于缺乏皮肤屏障的保护,将导致水电解质紊乱、感染、能量和营养物质的流失,从而严重威胁到人的生命。硅橡胶是一种具有多种优良性能的高分子材料,例如较好的力学性能、化学稳定性和气体通透性,尤其值得一提的是,硅橡胶具有良好的生物相容性。这些优良的性能,使得硅橡胶成为一种制备创面敷料的理想材料。虽然硅橡胶具有很好的生物相容性并可用作创面敷料的制备,但目前单纯利用硅橡胶这种材料来制备敷料国内外均未见相关报道。当前硅橡胶的主要运用方向仍是用作整形美容的填充物,或仅仅是用作一些人工皮肤/生物支架的外层保护薄膜。在本课题研究中,我们成功利用医用硅橡胶制备了多孔薄膜,同时摸索了硅胶膜孔径尺寸的调节方法并探讨了不同孔径硅橡胶薄膜的体内外生物学作用及相关机制。由于已有的文献报道各种多孔创面敷料/组织支架对于细胞增殖以及组织修复有着显著影响,结合硅橡胶材料自身良好的理化性能及生物相容性,我们预测制备的多孔硅橡胶薄膜具有作为一种新型敷料应用于烧创伤创面治疗的潜力。虽然我们所制备的多孔硅橡胶薄膜具有作为新型敷料的应用前景,但多孔硅橡胶薄膜对创面愈合有无影响、有何影响及其影响机制是什么仍有待阐明。同时,根据生物学实验的结果进一步优化及确定多孔硅胶膜的相关制备参数显得十分重要,并在此基础上,模拟人皮肤的表皮-真皮样双层结构制备性能更加完善的双层复合仿生敷料。利用硅橡胶进行仿生创面敷料的制备,是对硅橡胶材料应用的进一步拓展,并且为临床皮肤创面的治疗提供新的治疗手段。目的本研究拟通过制备不同孔径结构的硅橡胶薄膜,并探索其对创面愈合的影响及其机制,从而优化相关制备参数,最终制备出一种新型双层仿生敷料,为临床皮肤创面的治疗提供一种新的手段。方法1.不同孔径结构的硅橡胶薄膜的制备及孔径结构的观察和测量通过溶剂挥发诱导的相分离法制备不同孔径结构的硅橡胶薄膜,扫描电镜观察孔径的结构,并测量孔径的尺寸;2.不同孔径结构硅胶膜的抗细菌侵袭能力通过向不同孔径结构的硅胶膜上表面接种细菌,平板计数法测量细菌穿透硅胶膜的量,比较硅胶膜不同的孔径结构阻挡细菌入侵的能力;3.不同孔径结构的硅胶膜对细胞增殖的影响及其增殖信号通路机制研究3.1分离原代绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,gfp)转基因新生鼠的成纤维细胞,并接种到不同孔径结构的硅胶膜表面,利用荧光显微镜观察细胞密度。同时扫描电镜观察细胞的生长形态;3.2通过向不同孔径结构的硅胶膜上接种成纤维细胞,cellcounting-8(cck8)法测量细胞在不同孔径结构的硅胶膜上的增殖情况;碘化丙啶(propidiumiodide,pi)染色,流式检测细胞周期;利用real-timepcr检测接种到不同硅胶膜上的细胞中wnt3a,β-catenin及增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,pcna)的表达;同时westernblot(wb)技术检测wnt/β-catenin信号通路的wnt3a,β-catenin,axin2,phosphorylatedgsk-3β(p-gsk-3β),gsk-3β,pcna的表达水平;最后在大孔径硅胶膜组加入了wnt/β-catenin信号通路抑制剂xav939,检测了细胞增殖及wnt/β-catenin信号通路的变化;4.不同孔径结构的硅胶膜对创面愈合的影响通过制备小鼠全层皮肤缺损创面模型,并将制备的不同孔径结构的硅橡胶薄膜应用于小鼠创面,观察小鼠创面的大体愈合情况,创面收缩情况;制备病理切片,通过苏木素-伊红(hematoxylinandeosin,he)染色,利用imageproplus6.0(ipp6.0)软件测量不同处理组的新生上皮长度;通过免疫组化及wb法检测wnt3a,β-catenin和pcna在小鼠创面组织中的表达情况;5.双层复合硅橡胶仿生敷料的构建及相关生物学测试5.1通过使用不同配方的成膜溶液,进行二次涂膜,构建模拟人表皮-真皮样双层结构的双层硅橡胶仿生敷料。第一次涂膜使用液体硅橡胶前驱物/液体石蜡/正己烷的质量比例为25/20/55w/w/w,涂膜厚度为1mm;第二次涂膜使用液体硅橡胶前驱物/液体石蜡/正己烷/司盘80的质量比例为25/5/68/2w/w/w/w,涂膜厚度为0.5mm。超景深显微镜下观察双层敷料的双层结构;5.2双层复合硅橡胶仿生敷料的理化性能测试;5.3皮下包埋实验在体验证双层复合硅橡胶仿生敷料的生物相容性;5.4利用小鼠全层皮肤缺损创面模型,与空白对照组,凡士林纱布组和无孔硅胶膜组进行对照,观察双层复合硅橡胶仿生敷料对创面愈合的影响;5.5制备组织病理切片,通过he染色测量创缘新生上皮长度和肉芽组织厚度,观察双层复合硅橡胶仿生敷料对创面愈合过程中上皮化和肉芽组织形成的影响;5.6通过pcna和cd31免疫组化染色,观察双层复合硅橡胶仿生敷料对创缘细胞增殖和创面血管化的影响;5.7制备冰冻切片,通过免疫荧光染色,观察细胞连接分子钙粘蛋白e(e-cadherin)的表达情况,从而初步探讨双层复合硅橡胶仿生敷料对创缘细胞移行的影响。结果1.成功制备了四种不同的硅橡胶薄膜,分别为极大孔径硅胶膜,大孔径硅胶膜,小孔径硅胶膜和无孔硅胶膜,通过扫描电镜图片测得其中前三种硅胶膜其孔径尺寸分别为218.03±17.95μm,110.47±14.03μm,5.27±1.44μm。无孔硅胶膜上无孔径结构形成;2.细菌学实验发现,与凡士林纱布、极大孔径、大孔径结构相比,小孔径结构和无孔硅胶膜可以显著的阻挡细菌的入侵,差异具有统计学意义(**p<0.01,n=3);3.不同孔径结构的硅胶膜对细胞增殖的影响及其增殖信号通路机制研究3.1我们成功分离培养了gfp转基因新生鼠的成纤维细胞。在接种至不同孔径的硅胶膜上后,荧光显微镜下观察发现:大孔径硅胶膜表面的细胞数量更多,密度更大;扫描电镜下观察发现大孔径硅胶膜上的成纤维细胞细胞状态最好,呈典型的纺锤样形态,而其他硅胶膜表面的成纤维细胞则形态不规则、不典型;3.2通过cck8法检测细胞在不同孔径硅胶膜表面的增殖情况发现:在接种后的第3天,大孔径硅胶膜上的细胞数量显著多于极大孔径、小孔径和无孔硅胶膜(**p<0.01,n=3);接种后第六天,极大孔径、小孔径和无孔硅胶膜上的细胞数量较接种的第一天到第五天已经出现明显的下降趋势,而大孔径硅胶膜上的细胞数量仍进一步增多,数量显著多于极大孔径、小孔径和无孔硅胶膜(**p<0.01,n=3);3.3real-timepcr检测发现,大孔径硅胶膜组细胞增殖标志物pcna的mrna表达水平最高,其次是极大孔径硅胶膜组和小孔硅胶膜组,表达最低的是无孔硅胶膜组;同时检测了wnt3amrna表达量,也发现大孔径硅胶膜组表达量显著高于极大孔径、小孔径和无孔硅胶膜组;而β-catenin的mrna表达量在大孔径硅胶膜组最高,小孔径硅胶膜组次之,极大孔径硅胶膜组和无孔硅胶膜组表达最低,差异具有统计学意义;3.4wb检测了wnt/β-catenin信号通路的表达变化,发现大孔径硅胶膜组的wnt3a和β-catenin的蛋白表达量较其余三组高(*p<0.05,n=3),p-gsk-3β表达量,p-gsk-3β/gsk-3β比值和pcna的蛋白表达量在接种至大孔径硅胶膜上的细胞中也最高,差异具有统计学意义。gsk-3β的蛋白表达量无差异(p=ns,n=3)。axin的蛋白表达量则在大孔径硅胶膜组中表达最低,其余三组间无差异;3.5加入wnt/β-catenin信号通路抑制剂xav939后,cck8法检测大孔径硅胶膜组细胞增殖情况发现,与未加抑制剂组相比,细胞生长受到显著抑制;同时,wb检测wnt/β-catenin信号通路的表达变化发现,wnt3a,β-catenin和pcna的表达也都受到抑制,而axin2的表达量上升,差异均具有统计学意义;3.6通过检测接种到不同硅胶膜上的细胞的细胞周期发现,接种后一天,极大孔径硅胶膜和大孔径硅胶膜上粘附生长的细胞中处于细胞周期s期的比例分别为30.80%和31.62%,显著大于小孔径和无孔硅胶膜组的比例(分别为21.32%和23.41%,*p<0.05,n=3)。接种后3天,大孔径硅胶膜上粘附生长的细胞中处于细胞周期s期的比例仍显著高于无孔硅胶膜组(*p<0.05,n=3);4.不同孔径结构的硅胶膜对创面愈合的影响4.1小鼠全层皮肤缺损创面愈合实验发现,伤后3天,极大孔径、大孔径、小孔径和无孔硅胶膜组的愈合率分别为40.28%,63.87%,56.85%和28.24%,伤后7天创面愈合率分别为63.42%,89.25%,68.59%和67.28%。伤后3、7天大孔径硅胶膜组的创面愈合率均显著大于其余三组(**p<0.01,n=5);4.2同时,伤后3天四组的平均创面收缩率分别为36.30%,60.09%,51.78%和24.67%,大孔径硅胶膜组的收缩率显著大于其余三组(*p<0.05,n=5)。而伤后7天的平均创面收缩率则分别为52.35%,56.58%,55.23%和57.93%,各组间无统计学差异(p=ns,n=5);4.3对病理切片分析发现,伤后3天各组新生上皮长度无差异。而伤后7天,极大孔径、大孔径、小孔径和无孔硅胶膜组创面新生上皮长度分别为761.9μm,1173.78μm,825.13μm和656.61μm,大孔径硅胶膜组新生上皮长度显著长于其余各组(**p<0.01,n=5);4.4通过免疫组化和wb来检测组织中wnt3a,β-catenin和pcna的表达。其中组化发现wnt3a在大孔径硅胶膜组创缘组织中呈明显的阳性深染,wb结果进一步证实了其表达量显著高于极大孔径、小孔径和无孔硅胶膜组(*p<0.05,n=3);大孔径硅胶膜组创缘组织中β-catenin的表达量也高于小孔径和无孔硅胶膜组(*p<0.05,n=3);pcna阳性细胞计数和wb检测都证实了增殖标记物pcna在大孔径硅胶膜组中的表达量是所有组别中最高,差异具有统计学意义;5.双层复合硅橡胶仿生敷料的构建及其生物学测试5.1通过超景深显微镜观察双层硅胶膜的结构可以发现,复合硅橡胶仿生敷料明显的分为两层结构,其中上层厚度:0.5±0.15mm,孔径大小:1.12±0.25μm;下层厚度:1.2±0.5mm,孔径大小:135.91±30.75μm;5.2经检测,双层硅胶膜力学性能优异(杨氏模量:0.16mpa,断裂伸长率:2427.64%),同时具有合适的水蒸气透过率(watervaportransmissionrate,wvtr,229.10g/m2/天),适宜应用于创面;5.3皮下包埋实验发现,双层硅胶膜皮下包埋后刺激产生的纤维囊厚度和凡士林纱布刺激产生的纤维囊厚度无差异,生物相容性较好;5.4创面愈合实验发现,与对照组、凡士林纱布组和无孔硅胶膜组相比,双层硅胶膜能显著加速创面的愈合,差异具有统计学意义(**p<0.01,n=5);5.5对病理切片的分析也同样发现双层硅胶膜可以显著促进创面新生上皮的生长和肉芽组织的形成;5.6通过对pcna和cd31的免疫组化染色,对创缘pcna阳性细胞和创面血管计数进一步发现,双层硅胶膜的使用可以促进创缘细胞的增殖,以及创面的血管化;5.7通过对e-cadherin的免疫荧光染色发现,双层硅胶膜的使用可以下调创缘表皮细胞间e-cadherin的表达,从而促进细胞迁移。结论总结本课题,可得到以下的结论:1.我们通过溶剂挥发诱导的相分离法成功制备了具有不同微孔结构的硅胶膜,其中孔径结构的形成是由于溶剂挥发导致了液体石蜡和液体硅橡胶的相分离,从而在硅橡胶内部形成液体石蜡珠滴,最后除去液体石蜡珠滴后便形成多孔硅橡胶膜;使用该方法制得的多微孔硅胶膜具有孔径尺寸可控、工艺简单、能耗低、成本低的优点;2.硅胶膜的不同孔径结构对于阻挡细菌入侵有着重要作用。其中小孔径结构(平均孔径:5.27μm)更利于阻挡细菌入侵,防止创面感染;3.硅胶膜的不同孔径结构对于细胞增殖有着重要影响,其中大孔径结构(平均孔径:110.47μm)的微孔硅胶膜最有利于细胞的粘附增殖。wnt/β-catenin信号通路参与了孔径对细胞增殖的调控;4.在体实验证实了大孔径结构的硅胶膜(平均孔径:110.47μm)利于创面的再生和修复,而110.47μm可能是硅橡胶材料制备创面敷料用于创面治疗的最适孔径;5.最后根据前期实验结果,在国内外研究中首次利用硅橡胶材料成功构建了上层小孔径,下层大孔径结构的双层仿生敷料。其上层较小孔径结构具备防止细菌入侵的屏障作用,下层的大孔径结构则利于创面细胞的增殖和修复。双层硅橡胶敷料整体则具备良好的理化性能和生物相容性,可以有效地保护创面并维持创面局部良好的微环境,从而最终促进创面修复。上述对材料的孔径结构对创面愈合的影响及其机制的研究,以及在此基础上构建出的新型硅橡胶敷料,为临床创面的治疗提供了新的手段和思路。