骨肉瘤是最为常见的骨原发恶性肿瘤,其发病率和死亡率在世界范围内呈现逐年升高的趋势。骨肉瘤通常来源于原始的间充质来源的转化细胞,如股骨远端,胫骨近端和肱骨近端,一般好发于二十岁左右的青年。针对DNA甲基化的修饰,已成为肿瘤治疗的一种新型靶点。DNA高甲基化在促使肿瘤抑制基因沉默的过程中起到了至关重要的作用,已成为人类癌症的研究热点,而这种现象与经典的基因突变具有相似的意义。甲基化Cp G结合蛋白(methyl-Cp G binding proteins,MBDs)是招募染色体沉默相关复合物结合到甲基化DNA上的重要桥梁分子,是介导高甲基化DNA抑制基因转录的重要蛋白家族,在肿瘤发生发展过程中异常高甲基化区域的出现使得MBD蛋白可能成为有意义的治疗靶点。目前针对表观遗传修饰的药物最大的缺点是会引起基因组低甲基化,导致整个基因组不稳定,因此研究以MBD蛋白为靶点的针对表观遗传学的抗肿瘤治疗比以DNA甲基转移酶为靶点的抗肿瘤治疗更具特异性,可减少副作用。在前期研究中,我们建立了成骨细胞恶性转化的模型,并利用基因芯片发现印迹基因TSSC3参与了成骨细胞的恶性转化,TSSC3启动子区呈高甲基化,TSSC3的表达沉默在骨肉瘤细胞获得失巢凋亡抵抗中起着至关重要的作用。TSSC3作为一种潜在的抑癌基因,可能成为骨肉瘤治疗的一个新靶标。我们设想,MBD蛋白可能在介导骨肉瘤TSSC3基因表达沉默中起作用。通常情况下,MBD蛋白,如甲基化Cp G结合蛋白2(Me CP2),甲基化Cp G结合域1(MBD1)以及MBD2,能够特异性的结合甲基化的Cp G,同时与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)相关。甲基化Cp G结合蛋白2(Methyl-Cp G-binding protein 2,Me CP2)是MBDs蛋白家族中被研究最为广泛的蛋白。Me CP2是人脑发育的必需蛋白,而且,Me CP2与许多的癌症和神经发育障碍性疾病密切相关。本研究采用染色质免疫沉淀法,首先通过四对引物检测Me CP2蛋白结合TSSC3基因的活性;然后选择两个特异性si RNA,在LV-Me CP2-RNAi处理过的细胞中观察Me CP2基因表达;CCK8检测空白LV-Me CP2-RNAi-CN与转染LV-Me CP2-RNAi的Sa OS2和U2OS细胞增殖水平的差异;通过划痕实验和Matrigel侵袭实验检测LV-Me CP2-RNAi对于U2OS和Sa OS2细胞迁移侵袭能力的影响;应用流式细胞分析U2OS和Sa OS2细胞的凋亡情况;细胞克隆形成实验检测LV-Me CP2-RNAi对于U2OS和Sa OS2细胞的抑制情况;通过建立U2OS和Sa OS2裸鼠皮下移植瘤模型,分为转染LV-Me CP2-RNAi组和未转染LV-Me CP2-RNAi组,之后测量移植瘤的体积;最后通过基因芯片筛选出与Me CP2相关的具有生物学意义的差异表达基因;通过硫化测序PCR法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)检测IGFBP4基因启动子区的Cp G甲基化水平。目的在于探索Me CP2在骨肉瘤发生发展中的作用及其机制,并以此为基础发现骨肉瘤的新的治疗靶点。主要结果如下:1.染色质免疫沉淀法检测Me CP2蛋白结合TSSC3基因的活性,结果显示Me CP2在U2OS和Sa OS2细胞中表达显著升高,表明Me CP2与TSSC3基因拥有最强的结合力。2.选择两个特异性si RNA,在LV-Me CP2-RNAi处理过的细胞中观察Me CP2基因表达,与对照细胞相比,LV-Me CP2-RNAi能降低Me CP2基因在U2OS和Sa OS2细胞中的表达,但同时也降低了TSSC3的表达,差异有统计学意义。3.CCK8实验显示LV-Me CP2-RNAi可抑制Sa OS2和U2OS细胞增殖力,差异有统计学意义。4.划痕实验和Matrigel侵袭实验检测LV-Me CP2-RNAi对于U2OS和Sa OS2细胞侵袭能力的影响,结果显示,与空白LV-Me CP2-RNAi-CN转染组相比,转染LV-Me CP2-RNAi组U2OS和Sa OS2细胞侵袭和迁移能力受到明显抑制,差异有统计学意义。5.应用流式细胞技术分析了U2OS和Sa OS2细胞的凋亡情况,结果显示与空白LV-Me CP2-RNAi-CN转染组相比,转染LV-Me CP2-RNAi组U2OS和Sa OS2细胞凋亡率增加,差异有统计学意义。6.细胞克隆形成实验显示LV-MECP2-RNAi可抑制Sa OS2和U2OS细胞克隆形成。结果提示LV-Me CP2-RNAi抑制U2OS和Sa OS2的体外成瘤能力,差异有统计学意义。7.裸鼠皮下成瘤实验显示LV-Me CP2-RNAi可抑制Sa OS2和U2OS细胞的体内成瘤能力,差异有统计学意义。8.通过基因芯片从49395个转录子中筛选出107个差异表达基因,34基因表达上调,73个基因表达下调。其中5个基因与骨肉瘤细胞增殖的功能改变密切相关,它们包括IGFBP4,HOXC8,LMO4,MDK和CTGF。9.通过硫化测序PCR法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)检测IGFBP4基因的Cp G甲基化,结果显示IGFBP4基因序列P1区Cp G岛显著的高甲基化。10.LV-Me CP2-RNAi能降低Me CP2基因在U2OS和Sa OS2细胞中的表达,同时增高了IGFBP4的表达,差异有统计学意义。主要结论如下:1.在骨肉瘤U2OS和Sa OS2细胞中,三种甲基化Cp G结合蛋白中Me CP2与TSSC3基因拥有最强的结合力,但这种作用并不是调节TSSC3表达的主要机制,具体机制还有待进一步研究。2.Me CP2的基因沉默可以阻断Me CP2的表达,抑制骨肉瘤U2OS和Sa OS2细胞的增殖、侵袭和转移及成瘤能力,并诱导肿瘤细胞的凋亡。3.Me CP2基因参与骨肉瘤细胞的增殖调控过程。其中IGFBP4、HOXC8、LMO4、MDK和CTGF基因可能参与了Me CP2介导骨肉瘤细胞增殖的过程。4.骨肉瘤Sa OS2细胞中IGFBP4基因可能是Me CP2的靶向分子,可以通过RNAi阻断降低Me CP2的表达水平,恢复IGFBP4的部分表达及抑制肿瘤的功能,从而改变肿瘤细胞生物学效应。