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研究背景及目的： 现已证明成纤维细胞是瘢痕疙瘩形成的功能性细胞，其增殖-凋亡调控的失衡是导致瘢痕疙瘩不断增生而且难以退化的细胞学基础，而且Fas介导的凋亡被认为在成纤维细胞的凋亡中发挥着重要的作用。Fas基因与瘢痕疙瘩形成间的联系也逐渐被国内外研究所认识及重视。我们课题组在国内外最先发现：1．Fas单克隆抗体在ng-ug水平即可迅速诱导增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡，而在相同浓度下，瘢痕疙瘩成纤维细胞对此却无反应。2．增生性瘢痕成纤维细胞膜表面Fas表达较低，但在正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞表面Fas却呈高表达，两者间差异显著，这说明瘢痕疙瘩细胞的凋亡异常不是由于缺乏受体所导致的。3．通过对瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas介导的死亡信号递质的研究发现，瘢痕疙瘩Fas介导死亡信号传导阻滞，而且阻断的位点位于上游。进一步研究发现：瘢痕疙瘩成纤维细胞编码胞浆区死亡域的Fas基因存在突变。编码Fas蛋白死亡域结构基因的突变可导致Fas蛋白功能丧失，从而影响瘢痕疙第一军医大学博士学位论文瘩或纤维细胞的正常凋亡。研究提示Fas基因的突变可能是导致疲痕疙瘩形成的重要因素。 因此，我们又使用了脂质体携带正常人Fas基因转染体外培养的瘫痕疙瘩细胞，结果发现:脂质体能有效地将Fas基因导入瘫痕疙瘩成纤维细胞，并且能重建被阻断的Fas通道。为解决脂质体携带目的基因转载效率低下及瞬时表达的问题，我们拟采用腺病毒作为载体来实施瘫痕疙瘩的基因治疗。方法:1.将目的基因从原始质粒中亚克隆到穿梭质粒PDC3巧中，运用真核细胞内重组的技术构建了携带Fas基因的常规重组腺病毒载体，在293细胞内进行病毒的扩增及纯化。2.将目的基因从原始质粒中亚克隆到穿梭质粒PAdTrack一CMV中，运用细菌内重组的技术构建了携带Fas基因的细菌内重组腺病毒载体，在293细胞内进行病毒的扩增后及纯化。3.同时通过真核细胞内重组构建了空腺病毒Ad(C)作为对照。4.通过MTT检测Ad一Fas仍)，^d一Fas(T)和Ad(e)三种腺病毒对瘫痕疙瘩成纤维细胞生长情况的影响。5.通过流式细胞仪和蛋白质印记分析检测Ad一Fas旧)，Ad一Fas(T)两种腺病毒感染人瘫痕疙瘩成纤维细胞后靶细胞内Fas蛋白表达量的变化。6.使用流式细胞仪检测瘫痕疙瘩成纤维在Ad一Fas(B)，Ad一Fas(T)第一军医大学博士学位论文两种腺病毒感染后FasMcab诱导的凋亡改变。7.构建疲痕疙瘩裸鼠模型。8.通过大体观察，常规病理及电镜观察检测瘫痕疙瘩组织块植入到裸鼠皮下后的变化。9.使用Ad一Fas(B)，Ad一Fas(劝两种病毒注射及其它辅助治疗手段，实施针对植入裸鼠皮下的瘫痕疙瘩组织的体内治疗方案。通过大体观察，常规病理及电镜观察检测瘫痕疙瘩组织块的变化。结果:1.成功地将目的基因从原始质粒中亚克隆到穿梭质粒PDC3巧中，经293细胞内重组构建了携带Fas基因的常规重组腺病毒Ad一Fas(T)，经过扩增后多次纯化，最终病毒滴度为1.3Xlo知n刀ml。2.成功将Fas基因从原始质粒中亚克隆到穿梭质粒PAdTrack一CMV中，在BJS 1 83细菌内重组，成功构建了携带Fas基因的细菌内重组腺病毒Ad一Fas(B)，经过扩增后多次纯化，最终病毒滴度分别为2.8x lolopfi刀inl。。3.通过真核细胞内重组构建了空腺病毒Ad(C)作为对照，Ad(C)的病毒滴度为1.6X 109p彻ml。4.在体外实验中，无论是何种病毒以及是否携带目的基因，也不论使用的病毒滴度的大小，病毒对瘫痕疙瘩成纤维细胞的生长曲线基本不产生影响。这表明我们所使用的病毒在瘫痕疙瘩成纤维细胞内并不增殖，该病毒是安全的。但在后续的FasMcab作用下，.Ad一Fas(B)及Ad一Fas(T)病毒转染后的瘫疙瘩成纤维细胞生长明显受到抑制。第一军医大学博士学位论文说明转染后的痕痕疙瘩成纤维细胞Fas通道得以重建。5.Fas(B)及Ad一Fas(T)病毒转染瘫疙瘩成纤维细胞后1周内，靶细胞内Fas蛋白表达阳性率明显增高，感染后第二天蛋白表达阳性率达到最高。6.Ad一Fas03)及Ad一Fas(T)病毒转染后的瘫疙瘩成纤维细胞，在后续的FasMcab诱导下均可以出现明显的细胞凋亡，病毒感染后第二天使用FasMcab诱导可以达到最高的细胞凋亡率。这提示在今后的治疗中我们可以在病毒注射后第二天给予辅助治疗因素。7.成功地构建了瘫痕疙瘩裸鼠模型。8.在动物实验中，单纯使用腺病毒注射后的瘫痕疙瘩组织块体积仅轻度缩小。因为裸鼠为免疫缺陷动物，所以该结果并不能否认病毒的直接治疗作用，在免疫性动物体内直接注射腺病毒的治疗效果尚无结论。9.前期注射Ad一Fas(B)或Ad-Fas(T)后，无论使用FasMcab还是曲安缩松作为后续治疗因素，其瘫痕疙瘩组织块均明显缩小。10.使用腺病毒治疗后，能有效地较少曲安缩松的使用，从而减轻类固醇类激素治疗的副作用。n.在相同的条件下细菌内重组腺病毒Ad一Fas仍)具有较常规腺病毒Ad一Fas(T)更好的疗效。结论:1.本文介绍的两种方法可以成功地构建出携带Fas基因的重组第一军医大学博士学位论文 腺病毒，即细菌内重组腺病毒Ad一Fas(B)及常规重组腺病毒 Ad一Fas(T)，并且构建出不