近年来,诸如SARS、MERS、禽流感和埃博拉等新发突发传染病疫情的暴发日趋频繁,人类面临病毒性传染病的现实和潜在威胁日益严峻,人类应对突发传染病的防控压力日感倍增,但愈来愈多的实际情况表明:当病毒发生突变或出现新型病毒而导致传染病疫情暴发时,原来的特异性防治药物难以发挥应有防控效果,甚至毫无疗效,而人类认知水平和科研周期的限制,又使具有显著疗效的新一代特异性预防和治疗药物难以在短时间内推出,极易导致疫情的迅速扩散和局部地区的灾难性暴发,不仅对当地的公共卫生服务造成极大的破坏,同时也对社会的政治和经济造成巨大的冲击。因此,依据病毒的基本生物学特性,针对病毒侵染宿主细胞的共性靶点,研发新型广谱性长效病毒感染抑制剂,对于应对病毒性传染病疫情的持续挑战具有重要意义。植物化合物被称为“第七类营养素”,广泛存在于日常食物,是一类对人体健康具有特殊作用的非营养性化学物质。相关研究发现部分植物化合物具有抑制病毒感染的生物活性,并逐渐成为抗病毒研究的热点之一,如表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate,EGCG),单宁酸(Tannins),黄芪多糖(Astragalus Polysacharin,APS)等。初步的研究结果显示:植物化合物的生物学效应主要表现在其对细胞膜生物学特性的影响和局部微环境平衡的改变等方面,部分植物化合物通过直接嵌入细胞膜脂质双层结构,改变细胞膜正常的功能性流动,进而发挥一定的生物学效应。病毒是一类专性细胞内寄生生物,只有顺利穿过宿主细胞膜并成功进入细胞内的病毒,才能完成其感染增殖周期,因此,细胞膜是绝大多数病毒必须突破的第一道宿主防御屏障,是其启动成功感染的“必经之路”,也是各种病毒必须克服的共性障碍。从宿主细胞的角度来讲,病毒对细胞膜的侵入是一个病理性的过程,必然会导致宿主细胞膜生理特性的一些变化,如细胞膜脂质双层结构的流动性或细胞膜电势电位的改变。针对此类植物化合物抑制病毒感染机制的研究,多数集中于干扰某一种病毒的特异性感染靶点的描述,而有关其广谱性抑制病毒感染机理的探索相对较少,尤其是关于在病毒感染宿主细胞的过程中,植物化合物对细胞膜的生物学效应是否能够拮抗或干扰病毒对宿主细胞膜的病理性影响,进而导致病毒的胞膜侵染和胞饮内吞功能障碍等方面的研究,国内外尚未见相关报道。本研究分别以流感病毒和腺病毒的细胞感染模型为基础,通过对表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),单宁酸(Tannins),黄芪多糖(APS)等三种植物化合物抑制病毒感染效果的初步评价,分析此三种植物化合物在不同条件下抑制病毒感染的特点和效力,分别利用荧光偏振技术和荧光标记膜电位检测技术,比较不同条件下,植物化合物和病毒对细胞膜流动性和膜电位的影响以及相关的变化规律,期望对植物化合物广谱性抑制病毒感染的机制开展一些初步的探索,并为研制广谱性的病毒感染抑制剂提供技术支持,切实提高整体应对病毒性传染病的预防能力和控制水平。一、EGCG、单宁酸和黄芪多糖体外抑制病毒感染效果的分析利用5型腺病毒细胞感染模型和甲型H1N1流感病毒细胞感染模型,通过中性红吞噬技术,分别开展EGCG、单宁酸和黄芪多糖等三种植物化合物对293A细胞和MDCK细胞的毒性分析研究,结果显示:1、EGCG、单宁酸和黄芪多糖对293A细胞的最大无毒性浓度(TC0)分别为640μg/ml、1280μg/ml和1280μg/ml,对照样品利巴韦林的TC0为640μg/ml。2、EGCG、单宁酸和黄芪多糖对MDCK细胞的最大无毒性浓度(TC0)分别为1280μg/ml、640μg/ml和1280μg/ml,对照样品利巴韦林的TC0为640μg/ml。显然,所筛选的三种植物化合物的细胞毒性均不高于已经获得安全许可的对照样品利巴韦林。为进一步明确此三种植物化合物体外抑制病毒感染的效果,分别利用感染剂量均为100TCID50的5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒,依次在病毒感染前、感染同时和感染后三种条件下,分别添加三种植物化合物,通过观察细胞病变(cytopathic effect,CPE),分析此三种植物化合物抑制CPE的有效浓度,结果显示:1、感染腺病毒时,EGCG在上述三种条件下的半数抑制浓度(IC50)分别为162±11μg/ml、607±29μg/ml和325±26μg/ml;单宁酸的IC50分别为303±47μg/ml、197±19μg/ml和400±40μg/ml;而黄芪多糖仅在病毒吸附前加入时具有一定的抑制作用,IC50为449±50μg/ml;对照样品利巴韦林的IC50分别为604±25μg/ml、561±52μg/ml和177±27μg/ml。2、感染甲型H1N1病毒时,EGCG在上述三种条件下的半数抑制浓度(IC50)分别为465±15μg/ml、543±37μg/ml和519±55μg/ml;在病毒吸附前和吸附同时添加单宁酸时,均可检测到明显的抑制作用,IC50分别为411±54μg/ml和234±36μg/ml;但没有检测到黄芪多糖抑制CPE效果,而对照样品利巴韦林仅在病毒吸附后添加时,具有抑制细胞病变的效果,IC50为330±24μg/ml。很显然,在细胞水平的安全使用浓度下,病毒感染前,首先添加EGCG温育60分钟预处理细胞,与病毒吸附的同时添加单宁酸温育60分钟,EGCG和单宁酸均具有显著的抑制细胞病变的作用,显示其拥有良好的预防性抑制腺病毒和流感病毒感染的应用价值。二、EGCG、单宁酸和黄芪多糖抑制病毒感染机制的初步研究甲型H1N1流感病毒是有囊膜的分节段RNA病毒,而腺病毒是无囊膜的双链DNA病毒,2种病毒的外形结构和蛋白组成差别巨大,同时其在细胞内的增殖策略也完全不同,但2者均须克服具有相同结构和功能特点细胞膜屏障,才能完成其有效感染和复制增殖过程,因此,宿主细胞膜应是EGCG、单宁酸和黄芪多糖等植物化合物发挥其广谱性干扰病毒侵染作用的理想靶标之一。为深入探索此类植物化合物的作用机制,本研究针对病毒侵染时所引起的细胞膜病理性改变,EGCG、单宁酸和黄芪多糖存在时对细胞膜结构和功能的影响,以及此类植物化合物的生物学效应对病毒感染的干扰/拮抗作用等一系列数据和指标,开展了相关的检测和比较分析。1、通过细胞膜电位特异性荧光探针Di BAC4(3)的标记,利用流式细胞荧光检测技术,分析细胞膜电位变化的特点,结果显示:宿主细胞分别被感染滴度为100 TCID50的5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒后,其细胞膜电位均呈下降趋势,细胞膜的去极化率分别升高38.12%与83.91%。三种植物化合物存在时对细胞的膜电位均有不同程度的影响,尤其是EGCG,可使293A细胞和MDCK细胞的膜电位显著升高,在640μg/ml的有效浓度下,可使293A细胞和MDCK细胞的膜电位去极化率分别降低29.38%和43.76﹪。在EGCG存在的条件下,可明显降低因病毒感染所导致的细胞膜电位升高的现象。尤其是在5型腺病毒感染前使用10μg/ml-640μg/ml浓度的EGCG干扰病毒感染时,宿主细胞膜去极化率降低1.31﹪-31.86﹪。Spearman双变量等级相关分析也表明,只有在5型腺病毒感染前,使用EGCG预处理293A细胞,其对宿主细胞膜电位的干预作用与其抑制病毒感染作用具有相关性(R=0.931,p>0.05)。2、通过DPH(1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene)荧光探针的标记,利用荧光偏振技术,检测细胞膜脂质双层结构的荧光各向异性(r)的变化特点(注:细胞膜荧光各向异性r与细胞膜流动性成反比),结果显示:宿主细胞分别被感染滴度为100 TCID50的5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒后,其细胞膜流动性显著升高,敏感细胞的膜荧光各向异性分别降低了13.57﹪和15.76﹪。EGCG、单宁酸和黄芪多糖均可使293A和MDCK细胞的膜流动性不同程度的降低,在640μg/ml浓度下,此三种物质可使293A细胞膜荧光各向异性分别升高32.61﹪、25.75﹪和5.22﹪;使MDCK细胞膜荧光各向异性分别升高36.56﹪、74.60﹪和3.37﹪。在病毒感染前、感染同时和感染后三种条件下,分别添加浓度为640μg/ml的三种植物化合物后,均能不同程度的降低因病毒感染而导致的宿主细胞膜流动性升高的病理性变化,添加单宁酸时,293A细胞膜荧光各向异性分别升高5.68﹪、5.08﹪和21.17﹪,MDCK细胞膜荧光各向异性分别升高78.45﹪、75.50﹪和70.92﹪;添加EGCG时,可使293A细胞膜荧光各向异性分别升高19.71﹪、2.26﹪和15.56﹪;于病毒感染前和感染后添加EGCG时,可使MDCK细胞膜荧光各向异性分别升高32.69﹪和34.82﹪;于病毒感染前添加黄芪多糖时,可使293A细胞膜荧光各向异性升高4.33﹪,于病毒感染前和病毒感染同时添加时,可使MDCK细胞膜荧光各向异性升高1.00﹪和7.12﹪。Spearman双变量等级相关分析结果也表明,EGCG和单宁酸在三种条件下,其对宿主细胞膜流动性的生物学效应与其抑制病毒感染的作用有明显的相关性。EGCG,单宁酸具有显著降低细胞膜流动性的生物学效应,此种效应可有效的拮抗因病毒感染而引起的细胞膜流动性升高的病理性变化,而这种拮抗效果与其抑制多种病毒感染的作用密切相关,显示此类植物化合物对宿主细胞的脂质双层膜结构的功能性影响,是其具有广谱性抑制病毒感染的重要机制之一。而对于宿主细胞膜电位的影响,是否是其具有广谱性抑制病毒感染机制之一,还需要进一步的研究。综上所述,在安全的使用浓度下,预防性先期使用EGCG和单宁酸等植物化合物,可以有效的抑制5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒的感染,具有进一步研发为广谱性病毒感染抑制剂的巨大潜力,而深入研究此类植物化合物的细胞膜生物学效应,为探索其广谱性抑制病毒感染的机制奠定了坚实的理论基础。