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G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCR）是人体基因组编码的数量最多的膜蛋白受体超家族,在生命活动过程中发挥重要调控作用,并且与糖尿病、阿尔兹海默症、肥胖和癌症等人体重大疾病密切相关。GPCR已经成为多种疾病的重要治疗靶点,最新统计数据显示,在美国食品药品监督管理局批准的上市药物中,靶向GPCR的药物约占34%,其药物研发价值巨大。褪黑素受体 MT1（melatonin receptor type 1）和 MT2（melatonin receptor type 2）（统称为MTs）属于A家族GPCR,其内源性配体为褪黑素。MTs在人体节律系统中发挥重要调控作用,同时与生殖、神经调节、免疫调节、心血管功能和内分泌等各种生命活动紧密相关。MTs也是治疗失眠症、情绪紊乱、Ⅱ型糖尿病、自身免疫病、癌症等多种疾病的重要靶点。虽然人体的MT1和MT2高度同源,但是两者在人体中的分布及信号通路却存在显著差异。例如,MT1在蓝斑和外侧下丘脑表达,而MT2主要在下丘脑网状核表达。褪黑素受体MT1能够招募Gi/oA和Gq/11,而MT2只能招募Gi/oA。MT1和MT2的生理功能也呈现出显著差异:MT1主要在睡眠的快速动眼期发挥调控作用,而MT2主要负责增加非快速动眼期的睡眠。但是,目前药物市场上的褪黑素类药物在MT1和MT2之间缺乏选择性,无法实现相关疾病的精准治疗。并且,由于MTs三维结构的空缺,MTs亚型选择性药物,特别是MT1选择性药物的研发仍然具有挑战性。综上可知,解析MTs激动剂结合口袋的精准构象对相关药物的研发具有重要意义。本研究利用单颗粒冷冻电镜技术解析了非选择性激动剂ramelteon和2-iodomelatonin、MT1选择性激动剂5-HEAT以及MT1部分激动剂UCM871结合的MT1-Gi复合物结构,同时解析了 ramelteon结合的MT2-Gi复合物结构。与非激活态MTs结构相比,激活态MTs配体结合口袋的核心区域更加紧凑,并且发现TM4（transmembrane α-helices 4）和TM5之间的“侧向通道”（溶剂通道）入口也发生了显著变化。首先,激活态MT1 Tyr5.38的重排使通道入口更狭窄。而在激活态MT2中,Tyr5.38的构象变化与MT1相反,从而使其通道入口更加广阔。分子对接实验证实MT1与MT2在“侧向通道”入口的构象差异能够应用于MT1选择性激动剂的研发。其次,“侧向通道”入口附近的His5.46向跨膜螺旋内部偏转,使激活态MTs产生了“纵向通道”,并发现MT1与MT2“纵向通道”的差异可以应用于MT1选择性bitopic激动剂的研发。通过分析激活构象和激活机制,发现MTs除了拥有A家族GPCR经典的功能motif外,还进化出一些独有的分子开关,它们协同调控MTs激活,最终导致激活态MTs胞内侧能够维持比其它GPCR-Gi复合物更广阔的状态。因此,MTs中的Gi与其它GPCR-Gi复合物中的Gi构象也显著不同。与非选择性激动剂结合的MT1-Gi复合物相比,5-HEAT和UCM871结合时,“侧向通道”入口的构象变化非常显著,MT1比MT2通道入口的结构可塑性更强是MT1能够被其选择性激动剂激活的重要原因。综上所述,本研究对深入理解MTs与配体的识别模式及激活的分子机制具有重要意义,为MTs亚型选择性配体的研发奠定了坚实的结构基础。