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肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是骨骼肌生长的主要负调控因子,由GDF8基因编码。GDF8基因自然突变或者人为突变的小鼠、猪、牛、羊、狗以及人等,都表现出骨骼肌明显增大的表型。GDF8基因在各种疾病引起的肌萎缩病症中,发挥着重要的调节作用。此外,除了对肌肉生长发育的调控,其对胚胎的发育、脂肪的生成及骨骼的形成等生理功能,都具有重要的调节作用。CRISPR/Cas9系统是源自于细菌的一种核酸酶与非编码小RNA构成的复合物,其在真核生物中能够对特定的DNA序列位点实行切割,引起DNA双链断裂(DSBs),在细胞自身DNA修复机制的作用下,实现基因编辑。本研究主要是利用CRISPR/Cas9系统对昆明小白鼠(简称小鼠)和新西兰大白兔(简称大白兔)的GDF8基因进行编辑,获得GDF8基因修饰的小鼠和大白兔个体。同时,利用CRISPR/Cas9系统对德保猪和水牛的成纤维细胞和胚胎的GDF8基因进行编辑,并获得GDF8基因编辑的成纤维单细胞克隆,再通过胚胎移植生产猪和水牛的GDF8基因编辑的个体。另外,针对目前CRISPR/Cas9系统介导的外源基因的定点插入和精确修复效率较低的问题,进行了探索。主要研究结果如下:1.CRISPR/Cas9系统介导的小鼠和大白兔GDF8基因的编辑本研究成功构建了 CRISPR/Cas9系统应用的相关载体:pCMV-T7-NLS-hSpCas9-NLS 和 phU6-gRNA。并对小鼠和大白兔的 GDF8基因核酸序列进行了同源性比对分析,共设计6条gRNA靶序列,并克隆至phU6-gRNA,同时构建了不同靶序列相应的RGS-CR报告载体,并利用RGS-CR报告载体,对有效的gRNA进行了筛选,最终得到了有效的gRNA E31和E32,其效率分别为78.8%和75.6%。其中E32靶序列在小鼠和大白兔的GDF8基因中完全一致。通过受精卵胞质注射和胚胎移植,获得了 GDF8基因编辑的小鼠,阳性率为23.3%。同时,利用CRISPR/Cas9系统,在兔的成纤维细胞和胚胎实现了 GDF8基因的编辑,编辑效率分别达52%和88.7%。在不同类型及不同质量的胚胎中,基因编辑效率存在一定的差异。同时通过RNA受精卵胞质注射,利用自体移植的方法,280枚胚胎移植到14只母兔体内,最终获得32只仔兔,4只为阳性,阳性率为12.5(4/32)。2.CRISPR/Cas9系统介导的猪和水牛GDF8基因的编辑本研究根据水牛和德保猪的GDF8基因序列,分别设计了 3条不同的gRNA靶序列,并克隆到phU6-gRNA。利用RGS-CR报告载体,共筛选出了 2条效率较高的靶序列,德保猪为2#和3#(相应的gRNA为DBgRNA2#和DBgRA3#),DBgRA3#(BugRNA3#)靶序列为德保猪和水牛的同源序列。通过电穿孔的方法,分别将hSpCas9/BugRNA3#和hSpCas9/DBgRNA 3#导入德保猪和水牛的成纤维细胞。24h后,加入G418进行筛选,连续筛选7~10天后,收集细胞进行检测。将PCR产物进行TA克隆,挑取单克隆进行测序,测序结果显示,CRISPR/Cas9系统引起的德保猪成纤维细胞的突变率为87.5%,引起的水牛成纤维细胞的突变率为78.9%。另外,将hSpCas9/DBgRNA2#通过电穿孔的方法导入德保猪的成纤维细胞,先用800 ng/μL的G418进行筛选,待有大批细胞死亡后用200 ng/μL的浓度维持筛选,7天后挑取单克隆,扩大培养后鉴定其突变率。结果显示,单克隆细胞的阳性率为53.3%(8/15)。同时,通过G418筛选,我们获得了 GDF8基因编辑的水牛成纤维单细胞克隆,其编辑效率为72.7%(8/11)。根据靶序列的筛选结果,分别将猪和水牛GDF8基因的3#靶序列克隆至 pSicoR-T7-gRNA,得到 pSicoR-T7-pig gRNA 和 pSicoR-T7-BugRNA 3#用于体外转录。将pCMV-T7-NLS-hSpCas9-NLS载体用MluI线性化,同时将 pSicoR-T7-piggRNA 和 pSicoR-T7-BugRNA 3#用 pSiI 线性化,然后利用体外转录试剂盒转录得到hSpCas9的mRNA和sgRNA。将mRNA和sgRNA以100:50 ng/μL的比例注入猪的孤雌激活胚胎、IVF胚胎和ICSI胚胎中。培养7天后收集胚胎,利用PCR和T7E1酶切检测突变。结果显示,在猪的孤雌激活胚胎中突变效率为3%(3/80),在IVF胚胎中突变率为25%(13/52),在ICSI胚胎中突变效率为36%(8/22)。利用相同的方法对水牛IVF胚胎的GDF8基因进行编辑,其突变率最高为18.8%(3/16)。3.CRISPR/Cas9系统的优化为了更好地研究CRISPR/Cas9系统介导的内源基因的编辑效率,我们将带有水牛3#靶序列的RGS-CR报告载体整合至HEK293T细胞的基因组,建立了 RFP(in frame)-target sequence-EGFP(out frame)稳定表达的 HEK 293T细胞系,RGS-293T。为了提高CRISPR/Cas9介导的基因编辑效率,我们对比了不同的hSpCas9表达载体,pcDNA3.1-NLS-hSpCas9-NLS-BGH polyA 和 pCMV-T7-NLS-hSpCas9-NLS-SV40 polyA,将不同的hSpCas9 表达载体分别与Bu3#gRNA载体共转染RGS293T细胞系,然后通过流式细胞仪分析基因编辑效率,最终的结果显示,pcDNA3.1-NLS-hSpCas9-NLS-BGH polyA介导的基因编辑效率高于pCMV-NLS-hSpCas9-NLS-SV40 polyA介导的基因编辑效率。为了提高CRISPR/Cas9介导的基因编辑效率,我们探讨了用VPA处理细胞和过表达HR相关因子对HR效率的影响。结果分析表明,当VPA浓度小于1mmol/L时,能够提高NHEJ的效率;当VPA浓度大于1mmol/L时,随着浓度的升高NHEJ的效率降低。同时,随着VPA浓度的升高,HR效率相应提高。荧光定量结果分析表明,随着VPA浓度的升高,NHEJ相关因子LIG4和XRCC4 mRNA的表达量也相应提高,DNA-PKcs呈先升高后降低的趋势。同时,提高VPA的浓度,HR相关因子——Mre11、Rad50、Rad51和BRCA2等因子的表达量也相应提高。过表达HR相关因子Rad51及EXO1和hSpCas9的融合蛋白也能够提高HR的效率。这说明,VPA能够通过促进HR相关因子的表达提高HR的效率。