目的本研究运用生物信息学方法筛选出miR-9-5p为转录因子Klf4的上游调控基因,进一步探讨了miR-9-5p调控转录因子Klf4对肝癌细胞增殖、迁移能力的影响及其分子机制,为肝癌的分子靶向治疗研究提供新的策略。方法1.通过生物信息学软件Targetscan、miRanda及miRmap交联预测转录因子Klf4的上游调控基因,筛选出miR-9-5p作为Klf4的上游调控基因。2.体外培养人肝癌细胞株SK-Hep-1、HCC-LM3、Huh7、Hep-3B和人永生化肝细胞株L02。细胞培养环境为37℃、含5%CO2的恒温培养箱。3.构建Klf4过表达质粒和敲除的si RNA及miR-9-5p的类似物和抑制物(mimic/inhibitor)。4.通过双荧光素酶报告基因实验、蛋白印记法(Western Blot)、实时荧光定量(quantitative real time transcriotion-polymerase chain reaction,q RT-PCR)实验检测miR-9-5p对Klf4的调控作用。5.通过CCK8细胞增殖、凋亡实验检测miR-9-5p下调Klf4基因对肝癌细胞增殖性的影响,利用Western Blot实验检测其增殖、凋亡相关蛋白AKT、Bcl-2、Bax的表达变化。6.通过划痕实验、Transwell迁移实验检测miR-9-5p靶向Klf4基因对肝癌细胞迁移性的影响。7.采用Western Blot、q RT-PCR实验检测Klf4和miR-9-5p在20对肝癌组织及正常组织中的表达,并分析二者之间的相关性。8.利用TCGA数据库分析肝癌组织中miR-9-5p表达与临床病理特征及预后的关系。结果1.miR-9-5p在肝癌组织中高表达,与Klf4表达呈负相关。2.Kaplan-Meier生存分析显示,miR-9-5p的高表达与肝癌患者的不良预后相关。3.miR-9-5p通过直接与Klf4的3’-UTR相结合,下调Klf4的表达。4.miR-9-5p通过下调Klf4的表达,促进肝癌细胞的增殖、迁移,抑制肝癌细胞的凋亡,此过程与调控凋亡相关蛋白AKT、Bcl-2/Bax有关。结论1.在肝癌组织中,miR-9-5p高表达,与Klf4表达呈负相关,提示miR-9-5p可能成为潜在的治疗靶点。2.miR-9-5p下调转录因子Klf4的表达促进肝癌的增殖、凋亡、迁移过程,可能与调控凋亡相关蛋白AKT、Bcl-2/Bax有关。