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海藻糖是由两个葡萄糖分子以α、α1→1糖苷键结合的非还原性双糖,对许多生物的抗逆耐受性起着重要作用.酵母细胞中的海藻糖由TPS1、TPS2、TPS3和TSL1四个基因负责合成,其编码的多肽组成一个海藻糖合酶复合体.TPS1基因编码UDP-葡萄糖依赖性的海藻糖-6-磷酸合酶,TPS2基因编码海藻糖-6-磷酸酯酶,TPS3和TSL1两个基因的产物可能对复合体起稳定和调节作用.实验证实TPS1基因就可以使生物体获得产生海藻糖的能力,酵母的海藻糖合成酶复合体中6-磷酸-海藻糖的脱磷酸化作用是非特异性的,它可由生物体内的其它酯酶所代替.提取酿酒酵母的总DNA,以此为模板,采用PCR的方法从酿酒酵母中克隆出了1.488kb的海藻糖合成酶基因TPS1片段,通过XbaⅠ和SmaⅠ双酶切,与同样经过XbaⅠ和SmaⅠ双酶切的pUC118载体质粒连接,转入大肠杆菌DH5α中,通过蓝白斑筛选重组子.经过酶切和PCR鉴定表明TPS1基因克隆进载体中.将克隆出的序列进行了测序.通过同样方法将该片段连接到pBI121载体上,转化海藻糖合成酶基因缺失的大肠杆菌(菌株号FF4169,FF4169:NIC4100otsA1∷Tn10,MC4100为otsaBA基因野生型菌株).生长曲线表明,带有克隆片段的转化株在0.5mol/L NaCl的高渗透压培养基中生长良好,而作为对照的缺失株则几乎不能生长.这表明克隆所得到的片段具有海藻糖合成酶活性.将带有TPS1基因的pBI121载体转入根癌农杆菌LBA4404中,构建了双元转化载体,经菌落原位杂交鉴定,证明TPS1基因已经转入农杆菌中.采用叶盘法利用转化了的农杆菌对草毒进行侵染,用无菌滤纸吸干叶片上多余菌液,在培养基上共培养三天,共培养后的叶片在附加40mg/L Kan和200mg/L Cef的再生培养基上选择培养,筛选出的不定芽在附加25mg/L Kan的草毒继代培养基上继续筛选培养并增殖,增殖后的草毒植株转入附加25mg/L Kan的生根培养基上生根,提取生根后抗性植株的DNA,经过PCR和点杂交鉴定,证实所获得植株为转化植株.