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研究背景胰腺癌起病隐匿、发展迅速,是预后最差的消化系统恶性肿瘤。在过去的几十年里,胰腺癌的治疗手段并没有取得实质性的进展,仍是以手术切除为主的综合治疗。但是,由于胰腺癌的高度侵袭转移性及对化疗不敏感,其整体5年生存率仅为9%。作为一种癌基因,WT1 蛋白(Wilm’s tumor 1 protein,WT1)相关蛋白(WT1 associated protein,WTAP)的促癌作用及相关机制已在多种恶性肿瘤中得到阐明,但WTAP与胰腺癌发生、发展的关系却未有报道。本研究的初步研究结果提示WTAP可能在胰腺癌中起到促癌作用。因此,明确WTAP在胰腺癌中的促癌作用及其下游分子机制将有望加深对胰腺癌发生、发展的了解,为胰腺癌的治疗提供新的潜在靶点,并有利于提高胰腺癌的个体化精准治疗及预后。研究目的探索WTAP对胰腺癌细胞增殖、侵袭转移、化疗耐药等生物学行为的调控作用及其下游信号通路;明确WTAP在胰腺癌组织中的表达及其预后价值。研究方法利用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色的方法在小样本量胰腺癌标本中初步明确WTAP的表达情况;使用MIAPaCa-2细胞株初步明确瞬时敲减WTAP对细胞体外侵袭转移能力的影响;通过慢病毒载体转染,筛选并建立WTAP过表达及敲减双向调节的稳转细胞株;利用细胞增殖实验、细胞周期检测及裸鼠原位移植瘤模型检测WTAP对胰腺癌细胞增殖能力的影响;利用transwell实验检测WTAP对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响,并在裸鼠原位移植瘤模型中进一步验证;利用细胞毒性实验及细胞凋亡实验检测WTAP对胰腺癌细胞吉西他滨化疗耐药的影响;利用实时定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)筛选 WTAP 的下游靶点,并利用基因表达谱交互分析(Gene Expression Proling Interactive Analysis,GEPIA)在肿瘤基因图谱计划(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中进行验证;利用western blot检测局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase,Fak)及Fak信号通路中关键分子的表达情况,并进一步利用RNA稳定性实验、RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)技术阐释WTAP对Fak的调控机制,进而利用Fak抑制实验验证Fak信号通路为WTAP在胰腺癌中发挥作用的重要下游靶点;最后利用免疫组织化学染色法,研究胰腺癌中WTAP的表达与临床病理参数之间的相关性及其预后价值。所使用的统计学方法包括Cox回归检验、Mann-Whitney U检验、Kaplan-Meier生存分析、Pearson卡方检验以及Student’s t检验。P值小于0.05认为具有显著性差异。研究结果1.WTAP对胰腺癌恶性表型的调控WTAP在胰腺癌组织中呈高表达,瞬时敲减WTAP可以抑制MIA PaCa-2细胞的体外侵袭转移能力(P<0.05);在MIAPaCa-2和BxPC-3的WTAP双向调节稳转细胞株中,WTAP过表达可以显著促进胰腺癌细胞的体内及体外侵袭转移能力,同时还可以显著提高胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗耐药,WTAP过表达组的吉西他滨半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)显著高于对照组(P<0.05)。相反,敲减WTAP则可以明显降低胰腺癌细胞的体内及体外侵袭转移能力,并可以明显抑制胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗耐药,WTAP敲减组的吉西他滨IC50值也明显低于对照组,结果同样具有统计学差异(P<0.05)。但是,WTAP过表达或敲减对胰腺癌细胞的体内及体外增殖能力、细胞周期改变均无明显影响(P>0.05)。2.WTAP对胰腺癌恶性表型调控的分子机制利用qRT-PCR技术筛选发现在WTAP瞬时敲减的MIAPaCa-2细胞中Fak mRNA的含量明显下降(P<0.05)。在MIAPaCa-2和BxPC-3稳转细胞株中,WTAP过表达时,Fak mRNA及其蛋白表达水平明显增高(P<0.05),同时Fak第397位点酪氨酸磷酸化水平、Src第416位点酪氨酸磷酸化水平、AKT第473位点丝氨酸磷酸化水平及Erk1/2的第202位点苏氨酸/第204位点酪氨酸磷酸化水平均明显增高,而总Src、总AKT及总Erk1/2表达水平未发生改变。当敲减WTAP时,可以观察到相反的实验结果。Fak抑制实验结果发现,GSK2256098显著降低了 Fak第397位点酪氨酸磷酸化水平、Src第416位点酪氨酸磷酸化水平、AKT第473位点丝氨酸磷酸化水平及Erk1/2第202位点苏氨酸/第204位点酪氨酸磷酸化水平。同时,GSK2256098还有效地降低了 WTAP过表达组胰腺癌细胞的侵袭转移能力及对吉西他滨的化疗耐药性(P<0.05)。以上结果表明Fak-PI3K-AKT及Fak-Src-GRB2-Erk1/2信号通路的激活介导了 WTAP诱导的胰腺癌细胞侵袭转移及对吉西他滨的化疗耐药。进一步的mRNA稳定性实验及RNA免疫共沉淀实验发现WTAP可以与Fak mRNA特异性结合并提高其稳定性(P<0.05)。3.WTAP在胰腺癌中的预后价值WTAP在胰腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。胰腺癌组织中WTAP表达水平与性别、T分期及TNM分期呈正相关(P<0.05)。单因素生存分析发现WTAP表达水平与患者预后相关(P<0.05),WTAP高表达患者的总体生存时间显著短于WTAP低表达患者(P<0.05)。多因素生存分析发现,WTAP高表达是胰腺癌患者预后不良的独立危险因素(P=0.039,HR=1.855)。结论1.WTAP可以促进胰腺癌细胞的体外及体内侵袭转移能力,并且可以提高胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗耐药。2.WTAP可以与Fak mRNA特异性结合并增加其稳定性,通过转录后调控的方式上调Fak的表达,进而激活Fak-PI3K-AKT及Fak-Src-GRB2-Erk1/2信号通路。3.GSK2256098(Fak抑制剂)可以有效地逆转WTAP诱导的胰腺癌细胞体外侵袭转移及对吉西他滨的化疗耐药。4.相较于癌旁组织,WTAP在胰腺癌组织中表达升高;WTAP高表达预示着患者预后不良,是判断胰腺癌患者预后的独立指标。