研究目的:通过化学交联曲妥珠单抗和重组南瓜蛋白构建免疫毒素T-CUS_245C,以增强HER-2靶向治疗疗效。基因工程方法将曲妥珠单抗可变区基因与南瓜蛋白基因序列通过连接子融合,构建HER-2单链抗体（Ts）重组免疫毒素Ts/CUS。检测T-CUS_245C及Ts/CUS的体外抗肿瘤活性,并研究T-CUS_245C内化作用及其同药效的关系,同时研究Ts/CUS同抗PD-1单克隆抗体联合在体外对肿瘤细胞表达PD-L1的影响。通过上诉研究了解以南瓜蛋白为毒素靶向HER-2受体的免疫毒素的药效、及其同其他药物联合应用的可能性,旨在改善曲妥珠单抗药效,提高其抗肿瘤作用,为拓宽HER-2靶向治疗窗提供理论基础以及实验依据。研究方法:1.重组南瓜毒素CUS_245C的表达鉴定原核表达系统表达,Ni-柱亲和纯化CUS_245C;质粒酶切,SDS-PAGE,Western Blot鉴定表达产物;2.抗CUS_245C单克隆抗体的制备杂交瘤技术表达小鼠源性抗CUS_245C单克隆抗体,Protein G亲和层析柱亲和纯化;3.T-CUS_245C的化学交联SPDP巯基化曲妥珠单抗,DTT解聚CUS_245C;交联反应后以透析法去除游离CUS_245C,镍柱纯化得T-CUS_245C;4.Ts的表达鉴定PCR酶切连接构建pET-32a（+）-Ts-His原核表达载体;流式细胞技术鉴定表达产物抗原亲和力及特异性,确保后续同南瓜毒素融合表达的准确性;5.Ts/CUS的构建、表达及纯化（GGGGS）3连接子连接CUS和Ts基因序列,PCR扩增,酶切连接入pET-32a（+）原核表达载体,IPTG诱导表达,Ni+柱亲和纯化;6.T-CUS_245C和Ts/CUS的鉴定SDS-PAGE和Western Blot分别鉴定T-CUS_245C和Ts/CUS分子量及其性质;流式细胞技术鉴定人源性肿瘤细胞BT-474、SK-BR-3、SK-OV-3、MCF-7以及MDA-MB-231胞膜上HER-2的表达情况,并检测T-CUS_245C和Ts/CUS对HER-2阳性细胞的结合活性;流式细胞术检测不同浓度药物诱导细胞的凋亡情况;7.T-CUS_245C和Ts/CUS的体外抗肿瘤活性SRB方法分别检测T-CUS_245C和Ts/CUS对HER-2表达程度不同的各细胞的增值抑制率;8.T-CUS_245C内化作用的检测FITC标记抗CUS_245C抗体,普萘洛尔和洛利普兰处理细胞,利用荧光共聚焦显微镜对T-CUS_245C内化情况及细胞器定位情况进行检测并观察上诉两种药物对细胞内化T-CUS_245C作用的改变,探究改变内化作用对T-CUS_245C抗肿瘤药药效影响;9.Ts/CUS联合Keytruda对肿瘤微环境的影响人外周血淋巴细胞同肿瘤细胞共培养,观察Ts/CUS联合Keytruda应用对肿瘤细胞PD-L1表达的影响和对淋巴细胞分泌IFN-γ的作用;研究结果:1.流式细胞术检测上述肿瘤细胞系HER-2表达情况:BT-474 HER-2表达最强,SK-OV-3次之,SK-BR-3较弱,而MCF-7和MDA-MB-231因抗原阴性被作为对照组细胞;2.大肠杆菌成功表达CUS_245C,镍离子亲和层析法纯化后,纯度高;3.免疫毒素T-CUS_245C偶联成功。SDS-PAGE结果显示T-CUS_245C存在不同的偶联分子比纯度高。Western blot明确交联产物条带中含有CUS。流式细胞技术显示,T-CUS_245C对HER-2阳性细胞亲和力未受交联影响并具有诱导细胞凋亡的作用;4.Sulforhodamine B检测T-CUS₂₄₅体外细胞增殖抑制作用。结果显示,和曲妥珠单抗、CUS_245C或曲妥珠单抗+CUS_245C相比较,交联免疫毒素T-CUS₂₄₅对HER-2阳性细胞株（SK-OV-3、SK-BR-3和BT-474）的增殖抑制作用明显,呈剂量依赖性和时间依赖性,72h的IC₅₀分别为0.07 nM、0.67 nM、0.37 nM、;120 h的IC₅₀分别为0.005 nM、0.03 nM、0.04 nM。对HER-2阴性细胞株MCF-7和MDA-MB-231则无明显的增殖抑制作用;5.荧光共聚焦显微镜显示随时间推移,T-CUS_245C逐渐进入HER-2阳性细胞胞质,并定位于溶酶体。但无法进入HER-2阴性细胞中。CUS_245C内化效应不明显;6.T-CUS_245C内化过程可被普萘洛尔促进,这一促进作用可被洛利普兰中和。SRB显示促进T-CUS_245C内化可增强其体外抗肿瘤作用,但给予磷酸二酯酶PDE4抑制剂洛利普兰后,T-CUS_245C细胞毒作用随之减弱;7.Ndel/Xhol酶切及质粒DNA测序结果表明成功构建HER-2scFv重组载体;经SDS-PAGE显示表达产物分子量约为25 kDa,流式细胞技术证明表达产物对能够特异性结合抗原,解离常数Kd值为119.6 nM,并且结合抗原的位点同曲妥珠单抗相同;8.质粒DNA测序及Ndel/Xhol酶切鉴定表明成功构建Ts/CUS重组载体,经SDS-PAGE显示表达产物分子量约为55 kDa,蛋白表达纯度高,Western Blot进一步验证表达产物性质。流式细胞技术检测Ts/CUS同HER-2scFv比,对HER-2阳性细胞亲和力未受改造影响;流式细胞技术体外初测药效证明Ts/CUS具有诱导细胞凋亡的作用;9.Sulforhodamine B检测Ts/CUS体外细胞增殖抑制作用。结果显示,同Ts相比,Ts/CUS对SK-OV-3、SK-BR-3和BT-474的增殖抑制作用明显,且呈剂量依赖性和时间依赖性。其作用72h的IC₅₀分别为0.43nM、1.8 nM、8.79nM,120h的IC₅₀分别为0.15nM、0.37nM、1.82nM,远低于CUS_245C对这几株细胞的IC50;10.在体外淋巴细胞/肿瘤细胞共培养体系中,应用Ts/CUS联合Keytruda后,对SK-BR-3细胞的杀伤作用较无药物处理组、单独应用Ts/CUS组和单独Keytruda组升高,差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞技术显示CD3CD4T淋巴细胞百分比升高,ELISA提示培养液中IFN-γ和IL-2均有升高,Ts/CUS联合Keytruda组升高最为明显,IFN-γ升高较IL-2显著。结论1.重组南瓜蛋白CUS_245C具有细胞毒作用,并能够同曲妥珠单抗通过化学交联的方法构建成免疫毒素T-CUS_245C,简化交联步骤,提高产物产量和纯度;2.通过化学交联,成功构建高产,高亲和的免疫毒素T-CUS_245C;3.T-CUS_245C具有体外抗肿瘤活性强,特异性高的特性;4.T-CUS_245C可内化进入细胞质,定位于溶酶体中,这一过程可被普萘洛尔增强,内化速率的增加或减弱与T-CUS_245C细胞毒作用相关;5.基因工程技术成功构建单链抗体免疫毒素Ts/CUS;6.Ts/CUS均具有体外抗肿瘤活性强,特异性高的特性;7.Ts/CUS联合Keytruda可体外激活淋巴细胞,促进其表达IFN-γ,提高抗肿瘤效应。