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目的:骨溶解疾病(Osteolysis)以骨质发生溶解为特征,是破骨细胞功能亢进,自发吸收骨的一类骨科疾病,如骨质疏松症,类风湿性关节炎等,目前其发生和发展的机制尚未有明确的解释。生物医用材料磷酸钙(Calcium Phosphates,CaPs)陶瓷的成分与骨骼无机盐成分相似,对骨骼更具亲和力,可广泛应用于骨修复。相关文献表明小粒径的磷酸钙陶瓷对骨缺损修复更具有良好的治疗效果。我们把三种具有纳米结构的CaPs,包括羟甚磷灰石(Hydroxyapatite,HA)、双相磷酸钙(Biphase calcium phosphate,BCP)和β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP(HA/β-TCP≈30/70))制备成粉末,探讨C5 7/BL6小鼠破骨细胞(Osteoclast,OC)和成骨细胞(Osteoblast,OB)经三种可注射性磷酸钙陶瓷处理后的分化及增殖状况,探讨其抑制破骨细胞的分子机制,并通过颅骨皮下注射LPS构建小鼠骨溶解模型,通过注射HA、BCP和β-TCP评价其对骨溶解潜在的治疗效果。方法:第一部分,将四川大学所赠送的可注射性磷酸钙陶瓷颗粒HA、BCP和β-TCP(HA/β-TCP≈30/70),使用透射电镜(TEM)观察三种不同的磷酸钙陶瓷(HA、BCP、β-TCP)的粒径大小,X-射线衍射分析(XRD)检测材料结构的变化。提取并筛选诱导培养出骨髓巨噬细胞(Bone Marrow Macrophages,BMM),探究三种磷酸鈣陶瓷(HA、BCP、β-TCP)颗粒对破骨细胞的抑制作用及对破骨细胞分化的信号网路的研究。MTT法检测三种磷酸钙陶瓷颗粒对BMM增殖的影响。TRAP染色观察三种磷酸钙陶瓷颗粒对破骨细胞分化的作用,并分析了破骨细胞的生长状态、形态及大小,而细胞核≥3则为诱导成功的破骨细胞。F-actin(肌动蛋白环)是破骨细胞具有骨吸收功能的标志,我们用荧光染色观察破骨细胞肌动蛋白环结构的完整性,探讨三种磷酸钙陶瓷颗粒(HA、BCP、β-TCP)对破骨细胞骨吸收性能的影响。PCR检测破骨细胞特征性基因(Acp5、Ctsk、Fos、Nfatc1、Oscar)的表达情况。在寻找破骨细胞分化相关网络通路方面,首先用PCR检测破骨细胞相关基因在经三种磷酸钙陶瓷处理后是否表达,上调亦或下调,其次用荧光素酶报告基因和Western Blot阐明经三种磷酸钙陶瓷(HA、BCP、β-TCP)处理巨噬细胞后抑制破骨细胞分化的关键机制,为磷酸钙陶瓷抑制破骨细胞分化找到可探讨的依据。第二部分,研究HA、BCP(HA/β-TCP≈30/70)、β-TCP对间充质细胞成成骨细胞分化的作用。用HA、BCP、β-TCP 处理骨髓间充质细胞(Bone Marrow Mesenchymal Cell,BMMC),茜素红染色观察羟基磷灰石、双相磷酸钙、β-磷酸三钙生物医用材料的成骨钙化结节的数量,茜素红反应了成骨细胞的成熟程度;ALP定量分析反应了 HA、BCP、β-TCP对成骨细胞分化及成熟的程度;PCR实验检测成骨特异性基因Alp、Col1a1、Opn、Runx2在各组的表达情况,以此来探讨三种磷酸钙陶瓷颗粒(HA、BCP、β-TCP)对成骨细胞的诱导性能。第三部分,构建LPS诱导的小鼠骨溶解模型并制备组织学切片。于9周-12周大的雄性小鼠颅骨的中缝线周围注射LPS,活化破骨细胞,构建骨溶解模型,并用Micro-CT及组织学染色等分析手段探讨其骨质溶解的严重程度及HA、BCP(HA/β-TCP≈30/70)和β-TCP对骨质溶解的保护作用。结果:(1)HA、BCP、β-TCP的粒径处于纳米级别,且X射线衍射分析验证了 BCP是由HA和β-TCP构成的,BCP具有良好的生物相容性,接下来我们将骨髓巨噬细胞(Bone Marrow Macrophage,BMM)接种于含有HA、BCP、β-TCP的培养基中,结果发现HA、BCP、β-TCP有利于巨噬细胞的生长和增殖,同时研究证明了 HA、BCP、β-TCP能够抑制破骨细胞的分化,且BCP的效果最好,由BCP处理后的破骨细胞比表面积小,且数量远远少于RANKL组。肌动蛋白环的稳定性低于RANKL组,意味着破骨细胞的骨吸收功能障碍,其次是β-TCP、HA组;在细胞机制研究方面,PCR结果表明经过HA、BCP、β-TCP处理BMM细胞后,NF-κB和NFATc1的活动受到了一定的影响,HA、BCP、β-TCP对NF-κB和NFATc1的活动有抑制作用。其次WB及荧光素酶报告基因结果进一步佐证了上述结果,研究发现,HA、BCP、β-TCP抑制了 NF-κB和NFATc1的活动,从而抑制破骨细胞的分化及骨吸收功能,这与以上结果保持一致,磷酸钙陶瓷可抑制破骨细胞的活动;(2)用HA、BCP、β-TCP处理骨髓间充质细胞(BMMC)7、14、21天后,我们发现HA、BCP、β-TCP具有骨诱导性,具有矿化成骨的趋势,能促进成骨细胞相关基因高表达,而加入BCP的组效果最佳;(3)HE染色,TRAP染色,免疫组化(OPN)染色结果表明,由LPS诱导的颅骨侵蚀程度较严重,LPS组有很明显的骨缺损现象,中缝线周围的孔隙率及孔隙数与Control比有统计学意义,边缘也较粗糙。对比LPS组,HA、BCP、β-TCP对LPS诱导的骨溶解具有保护作用,能够防止骨量丢失,孔隙数及孔隙率远远少于LPS组,而BCP组的修复程度则接近于Control组,均有统计学意义。结论:(1)HA、BCP和β-TCP等三种磷酸钙陶瓷可以抑制破骨细胞的分化和骨吸收功能;(2)三种磷酸钙陶瓷(HA、BCP、β-TCP)作用于破骨细胞,通过探讨抑制NF-κB和NFATc1的活性达到对破骨细胞分化和功能干扰的目的;(3)HA、BCP和β-TCP具有诱导骨髓间充质细胞成成骨细胞分化的作用,具有骨诱导性;(4)三种磷酸钙陶瓷(HA、BCP、β-TCP)颗粒能够通过对破骨细胞分化的抑制作用以及对成骨细胞骨诱导性来保护骨量,防止骨量丢失;(5)在三种磷酸钙陶瓷颗粒对成骨细胞和破骨细胞的作用研究中,BCP的效果最好,β-TCP次之,而HA的效果没有BCP和β-TCP 显著。