目的：　　1.在粪肠球菌中建立体外防细菌耐药突变浓度（Mutant PreventionConcentration，MPC）的测定方法，通过测定4种氟喹诺酮类药物(FQs)环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星对粪肠球菌ATCC29212、ATCC29212同源耐药突变体及临床分离粪肠球菌的最低抑菌浓度(MIC)、防耐药突变浓度(MPC)和耐药突变选择窗(Mutant Selection Window，MSW)，比较不同的氟喹诺酮类药物的抗菌能力，并结合已有的药代动力学参数，比较4种药物的防细菌耐药突变的能力。　　2.探讨不同化学结构、不同浓度的FQ药物对耐药突变株恢复生长的影响和在耐药突变选择窗(MSW)内筛选的细菌耐药突变体的分子耐药机制。　　3.结合MPC、MSW理论、药代动力学和药效动力学(PK/PD)理论对临床优化氟喹诺酮类药物的给药方案提供初步依据。　　方法：　　1.应用肉汤富集细菌法富集1010cfu/ml粪肠球菌，采用标准的琼脂二倍稀释法测定4种氟喹诺酮类药物对粪肠球菌标准菌株ATCC29212、ATCC29212同源耐药突变株的最低抑菌浓度(MIC)、MIC99、暂定MPC(MPCpr)及防耐药突变浓度(MPC)，同时进行菌落计数法测定和描记细菌恢复生长曲线，计算比较ATCC29212及其同源耐药突变体的耐药突变选择窗(MSW)和选择指数SI(MPC/MIC)。　　2.在相应药物的耐药突变选择窗内筛选细菌耐药突变株，应用PCR技术对gyrA和parC的喹诺酮耐药决定区(QRDR)进行扩增，测序后进行在线Blast比对，确定其靶位突变位点，并采用外排泵表型抑制试验测定利血平对环丙沙星和加替沙星MIC的影响。　　3.琼脂二倍稀释法测定4种FQs药物对40株环丙沙星敏感的和15株环丙沙星耐药的粪肠球菌临床分离株的MIC及MPCpr，计算MIC90、MPCpr90及选择指数SI(MPCpr90/MIC90)，比较4种氟喹诺酮类药物在临床治疗剂量条件下的防耐药突变能力。　　结果：　　1.4种氟喹诺类药物对粪肠球菌ATCC29212的MIC99由低到高为:莫西沙星＜加替沙星＜左氧氟沙星＜环丙沙星，MIC99的结果提示，莫西沙星的抗菌活性最强;加替沙星、莫西沙星、左氧氟沙星和环丙沙星对粪肠球菌ATCC29212的MPC分别为1.2、1.2、5.6和6.4μg/ml，选择指数(即MPC/MIC99)分别为3.4、6、8和8，以加替沙星的选择指数最小。粪肠球菌ATCC29212的细菌恢复生长曲线显示，莫西沙星和加替沙星的平台期小于环丙沙星和左氧氟沙星。　　2.4种FQs药物对粪肠球菌ATCC29212同源第一步突变体的MIC较源菌株ATCC29212升高2～4倍，其他氟喹诺酮类药物对其MIC值也有2～4倍的升高，对加替沙星筛选第二步突变体的MIC较第一步突变体又升高2～4倍。粪肠球菌ATCC29212经4种FQs筛选出的第一步耐药突变体对环丙沙星已达到耐药，对左氧氟沙星也达到了中介耐药(MIC=4μg/ml)，而对莫西沙星和加替沙星仍然敏感（MIC:0.5～2μg/ml），但第二步突变体对莫西沙星和加替沙星也已达到了中介耐药(MIC=4μg/ml);4种FQs药物对第一步耐药突变体的MPC值均较ATCC29212源菌株升高2～4倍;加替沙星和莫西沙星对第一步突变体的MPC值均低于左氧氟沙星和环丙沙星，对第二步耐药突变体的MPC已高达32μg/ml;加替沙星、莫西沙星和左氧氟沙星对第一步耐药突变体的MSW较源菌株增宽。　　3.根据4种FQs对粪肠球菌ATCC29212的MSW测定结果以及加替沙星筛选第二步耐药突变株，共随机筛选了32株同源耐药突变株，对该32株同源耐药突变株的gyrA和parC的QRDR进行耐药突变位点分析，发现一步耐药突变株中均没有出现碱基位点的突变，而只有加替沙星筛选的第二步耐药突变株出现了parC的QRDR位点突变，主要是第80位氨基酸密码子的改变Ser80→Ile(AGC→ATC);利血平抑制实验提示主动外排机制介导了非靶位改变的耐药突变株的耐药性。　　4.加替沙星、莫西沙星、左氧氟沙星和环丙沙星对40株环丙沙星敏感的粪肠球菌临床分离株的MPCpr90分别为2、1、4和4μg/ml，选择指数(SI)分别为4、4、8和8;加替沙星和莫西沙星对15株环丙沙星中介耐药的粪肠球菌临床分离株的MPCpr90分别为32和16μg/ml，选择指数均达到了32。　　结论：　　对于粪肠球菌ATCC29212、ATCC29212同源耐药突变株及粪肠球菌临床分离株，加替沙星和莫西沙星的抗菌活性均高于左氧氟沙星和环丙沙星，且加替沙星和莫西沙星限制粪肠球菌耐药突变体被选择出来的能力强于左氧氟沙星和环丙沙星，参照药动学参数，环丙沙星和左氧氟沙星很容易筛选出下一步耐药突变株，而加替沙星和莫西沙星则能限制下一步耐药突变株的产生。但对于第二步耐药突变株，加替沙星和莫西沙星的MPC增高，MSW增宽，也很容易筛选出对这两种药物也耐药的菌株。由此可以看出，临床上为延长加替沙星和莫西沙星的使用寿命，对于环丙沙星已经达到了耐药的菌株应避免再用加替沙星和莫西沙星的单药治疗方案。另外，从本次研究也可以看出，粪肠球菌对FQs类药物的耐药性是逐步产生和发展的，一旦发生第一步的耐药性突变，其MPC值逐渐增高，MSW逐渐增宽，导致第二步耐药突变体更加容易被选择出来，只有将第一步耐药性突变阻断后，才有可能抑制细菌对氟喹诺酮类药物的耐药进展，而对氟喹诺酮类药物敏感性下降的粪肠球菌同源耐药突变株，主要是编码拓扑异构酶Ⅳ的ParC亚单位基因（parC）发生了单个点突变(AGC→ATC)，导致其相应的第80位氨基酸由丝氨酸突变成了异亮氨酸(Ser80→Ile)，对于非靶位改变的耐药突变株，其耐药机制可能主要由外排泵所介导，但具体的泵机制所导致的对氟喹诺酮类药物的耐药性还需进一步的研究。