斑马鱼Tac3a;Tac3b;Gnrh3敲除品系的建立及表型检测

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神经激肽B(Neurokinin B,NKB)和促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)在脊椎动物生殖调控中起着关键作用。NKB是速激肽家族的成员,由tac2/3基因编码。研究表明,人类中NKB/NK3R无效突变导致先天性促性腺激素功能减退症(isolated hypogonatropic hypogonadism,IHH),在小鼠研究中的研究也显示NKB/NK3R无效突变会导致低促性腺素性腺功能减退和不育。GnRH在脊椎动物的下丘脑-垂体-性腺轴中起主要调节功能,刺激卵泡刺激素和促黄体激素的合成与分泌。为了研究它们在鱼类生殖系统中的功能,本研究通过转录激活剂样效应核酸酶(Transcription Activator-like Effector Nucleases,TALEN)技术,建立了tac3a-/-tac3b-/-、tac3a-/-gnrh3-/-和tac3a-/-tac3b-/-gnrh3-/-斑马鱼品系,研究NKB和GnRH3信号缺失对斑马鱼生殖的影响。主要研究结果如下:1、通过测序进行筛选和传代,我们成功从P0代嵌合体斑马鱼中获得tac3a、tac3b和gnrh3纯合单突变的斑马鱼品系,并且编码NKB和GnRH3成熟肽的序列提前出现终止密码子。通过对tac3a、tac3b和gnrh3纯合单突变的斑马鱼品系进行杂交筛选获得tac3a-/-tac3b-/-、tac3a-/-gnrh3-/-和tac3a-/-tac3b-/-gnrh3-/-斑马鱼品系,并通过定量PCR证实tac3a、tac3b和gnrh3在对应突变斑马鱼品系中已被成功敲除。2、在tac3a-/-tac3b-/-斑马鱼品系中,其生长发育不受影响,成熟个体能正常进行配子发生和繁殖,同时发现tac3a和tac3b的基因表达存在补偿效应。在tac3a-/-gnrh3-/-斑马鱼品系中,其生长发育比野生型斑马鱼发育慢,但成熟个体能正常进行配子发生和繁殖。3、在tac3a、tac3b和gnrh3基因全部突变的斑马鱼中,其生长发育在性别分化、青春期启动和性腺成熟阶段均比野生型斑马鱼发育慢。同时,在tac3a-/-tac3b-/-gnrh3-/-斑马鱼品系中,成熟个体中没有发现雌鱼,均为雄鱼。进一步研究表明,NKB和GnRH3对其性腺表型的影响发生在性别分化时期。在性别分化之前通过投喂NKB和LHRH多肽,可以部分拯救tac3a-/-tac3b-/-gnrh3-/-斑马鱼的性腺表型,其卵巢样性腺发育为卵巢。我们的研究结果表明:NKB和GnRH3信号的共同缺失会导致斑马鱼性别分化过程的异常。这也是首次在脊椎动物中建立了tac3a;tac3b;gnrh3敲除模型,为鱼类NKB和GnRH3的研究提供有效的模型,有助于揭示动物性别分化调控的新机制,也为控制重要经济动物的性别提供新思路。
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