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屈昔多巴(L-threo-DOPS)是一种新的抗帕金森病手性药物,可改善由帕金森病引起的步态僵直与直立性头晕。随着生物技术和工程技术的融合发展,应用生物催化技术来大规模制备L-threo-DOPS将成为可能。文献研究发现L-苏氨酸醛缩酶(L-TA)可催化3,4-二羟基苯甲醛和甘氨酸可逆缩合生成L-threo-DOPS,此方法条件温和,没有重金属污染,不使用剧毒化学品,具有很好的应用前景。但目前应用于L-threo-DOPS生物合成的L-TAs存在β-羟基的立体选择性差的问题,难以实现工业化。
对环境样品进行宏基因组测序使得我们能够更快更好地了解其微生物组结构与功能,挖掘其中的功能基因。因此,本文基于宏基因组学的研究策略,着眼于获取高de值的L-TAs,引入NCBI数据库比对分析技术与融合蛋白表达技术,挖掘到一个新的L-TA(命名为Sz-1-2),研究了Sz-1-2合成L-threo-DOPS的最优条件,为大规模生物合成L-threo-DOPS提供数据支撑;在此基础之上,基于生物信息学分析,对Sz-1-2活性口袋残基进行了分子改造,获得了de值提高的突变型R318C,并进而对318位进行了饱和突变研究,为L-threo-DOPS的生物合成提供优质酶。进一步采用三维结构同源建模分析法以及分子对接法等探讨了突变体R318M,R318V和R318L de值提高的原因。本研究扩展了L-TAs的天然酶库,为应用生物催化技术大规模制备L-threo-DOPS提供了新的资源。
主要研究结果和结论如下:
(1)在本课题组前期获得的黑熊肠道微生物宏基因组数据库的基础上,挖掘了一个新的L-TA,命名为Sz-1-2。①同源性及进化树分析表明Sz-1-2属于PLP依赖醛缩酶家族。②SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS质谱分析表明Sz-1-2分子量大小与理论预测38.68kDa相符。③Sz-1-2对L-苏氨酸的比活高于大多数报道的L-TA。同时其合成L-threo-DOPS的de值为21%,高于目前报道的野生型L-TA(de值=14%),表明其在生物催化合成屈昔多巴的应用上拥有一定潜力。
(2)系统研究了Sz-1-2合成L-threo-DOPS的最优条件。①对Sz-1-2的酶促动力学进行研究发现,Sz-1-2具有较小的Km值和较大的(kcat/Km)。同时,Sz-1-2是对L-苏氨酸具有更高亲和力的稀有例子,表明其具有高非对映选择性合成L-threo-DOPS的更高可能性。②经过条件优化得到的最佳反应条件为:底物为1M甘氨酸,60mM3,4-二羟基苯甲醛,辅酶为50μM磷酸吡哆醛,在pH7.5PBS缓冲液中反应4h。利用最佳反应条件合成L-threo-DOPS,得到优化后Sz-1-2的非对映选择性为30.2%,较优化前的de值21%提高了43.8%。酶促动力学与最优合成条件的研究为Sz-1-2的后续研究和应用提供了数据参考。
(3)基于生物信息学分析,对Sz-1-2的活性口袋残基进行了分子改造,获得了十个Sz-1-2突变体,并进一步选择了318位残基进行饱和突变。①对第一轮突变的十个突变体的活性与de值研究结果表明,仅突变体R318C在合成L-threo-DOPS反应中表现出de值提高,约为野生型的1.7倍,达到了53.6%,所以选择Arg318作为第二轮饱和突变位点。②对第二轮Arg318饱和突变体的de值研究结果发现,大多数Arg318突变体表现出提高的非对映选择性。突变体R318M,R318V和R318L在L-threo-DOPS的合成中表现出显着提高的de值(分别为77.1%,79.9%和84.9%),其中R318L突变体的非对映选择性最佳,为野生型Sz-1-2的2.8倍。de值提高的突变体的获得将使应用生物催化技术大规模制备L-threo-DOPS成为可能。
(4)应用SWISS-MODEL对野生型Sz-1-2和突变体R318M,R318V与R318L进行三维结构同源建模,并用CDOKER将底物与辅酶复合物对接至活性口袋。结果显示,对于野生型Sz-1-2,残基Arg318和Arg172与L-threo-DOPS/PLP复合物的羧基强烈相互作用,使该复合物采用酚羟基指向His128的构象。而当残基Arg318被那些非极性氨基酸取代,Arg318与L-threo-DOPS/PLP配合物的羧基之间的相互作用消失,而Arg172仍然起一定作用,从而导致配合物的独特结合方式,其中该复合物的酚羟基远离His128,并指向那些具有非极性氨基酸的318突变位点。表明野生型Sz-1-2及其突变体R318M,R318V,R318L中L-threo-DOPS/PLP复合物的明显不同构象可能有助于非对映选择性的显着提高。这些结果表明Arg318对于Sz-1-2的非对映选择性非常重要。
对环境样品进行宏基因组测序使得我们能够更快更好地了解其微生物组结构与功能,挖掘其中的功能基因。因此,本文基于宏基因组学的研究策略,着眼于获取高de值的L-TAs,引入NCBI数据库比对分析技术与融合蛋白表达技术,挖掘到一个新的L-TA(命名为Sz-1-2),研究了Sz-1-2合成L-threo-DOPS的最优条件,为大规模生物合成L-threo-DOPS提供数据支撑;在此基础之上,基于生物信息学分析,对Sz-1-2活性口袋残基进行了分子改造,获得了de值提高的突变型R318C,并进而对318位进行了饱和突变研究,为L-threo-DOPS的生物合成提供优质酶。进一步采用三维结构同源建模分析法以及分子对接法等探讨了突变体R318M,R318V和R318L de值提高的原因。本研究扩展了L-TAs的天然酶库,为应用生物催化技术大规模制备L-threo-DOPS提供了新的资源。
主要研究结果和结论如下:
(1)在本课题组前期获得的黑熊肠道微生物宏基因组数据库的基础上,挖掘了一个新的L-TA,命名为Sz-1-2。①同源性及进化树分析表明Sz-1-2属于PLP依赖醛缩酶家族。②SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS质谱分析表明Sz-1-2分子量大小与理论预测38.68kDa相符。③Sz-1-2对L-苏氨酸的比活高于大多数报道的L-TA。同时其合成L-threo-DOPS的de值为21%,高于目前报道的野生型L-TA(de值=14%),表明其在生物催化合成屈昔多巴的应用上拥有一定潜力。
(2)系统研究了Sz-1-2合成L-threo-DOPS的最优条件。①对Sz-1-2的酶促动力学进行研究发现,Sz-1-2具有较小的Km值和较大的(kcat/Km)。同时,Sz-1-2是对L-苏氨酸具有更高亲和力的稀有例子,表明其具有高非对映选择性合成L-threo-DOPS的更高可能性。②经过条件优化得到的最佳反应条件为:底物为1M甘氨酸,60mM3,4-二羟基苯甲醛,辅酶为50μM磷酸吡哆醛,在pH7.5PBS缓冲液中反应4h。利用最佳反应条件合成L-threo-DOPS,得到优化后Sz-1-2的非对映选择性为30.2%,较优化前的de值21%提高了43.8%。酶促动力学与最优合成条件的研究为Sz-1-2的后续研究和应用提供了数据参考。
(3)基于生物信息学分析,对Sz-1-2的活性口袋残基进行了分子改造,获得了十个Sz-1-2突变体,并进一步选择了318位残基进行饱和突变。①对第一轮突变的十个突变体的活性与de值研究结果表明,仅突变体R318C在合成L-threo-DOPS反应中表现出de值提高,约为野生型的1.7倍,达到了53.6%,所以选择Arg318作为第二轮饱和突变位点。②对第二轮Arg318饱和突变体的de值研究结果发现,大多数Arg318突变体表现出提高的非对映选择性。突变体R318M,R318V和R318L在L-threo-DOPS的合成中表现出显着提高的de值(分别为77.1%,79.9%和84.9%),其中R318L突变体的非对映选择性最佳,为野生型Sz-1-2的2.8倍。de值提高的突变体的获得将使应用生物催化技术大规模制备L-threo-DOPS成为可能。
(4)应用SWISS-MODEL对野生型Sz-1-2和突变体R318M,R318V与R318L进行三维结构同源建模,并用CDOKER将底物与辅酶复合物对接至活性口袋。结果显示,对于野生型Sz-1-2,残基Arg318和Arg172与L-threo-DOPS/PLP复合物的羧基强烈相互作用,使该复合物采用酚羟基指向His128的构象。而当残基Arg318被那些非极性氨基酸取代,Arg318与L-threo-DOPS/PLP配合物的羧基之间的相互作用消失,而Arg172仍然起一定作用,从而导致配合物的独特结合方式,其中该复合物的酚羟基远离His128,并指向那些具有非极性氨基酸的318突变位点。表明野生型Sz-1-2及其突变体R318M,R318V,R318L中L-threo-DOPS/PLP复合物的明显不同构象可能有助于非对映选择性的显着提高。这些结果表明Arg318对于Sz-1-2的非对映选择性非常重要。