鸭疫里默氏杆菌(R.anatipestifer)是引起水禽细菌性疾病的主要病原之一。目前公认的血清型众多,各血清型之间很少有交叉保护作用,虽然疫苗的效果很显著,但受血清型的局限,R.anatipestifer感染还是很难得到控制,所以实际生产中使用大量的化学药物对鸭疫里默氏杆菌病进行治疗。但是到目前为止,关于R.anatipestifer耐药机理的文献有限,因此本论文根据目前我国用药的现状,对分离自我国不同地区和时间的R.anatipestifer的耐药性、基因型和耐药机理进行了系统的研究,报告如下:1.为了研究分离自我国RA临床株的耐药性和耐药变迁规律有,采用K-B纸片法对1998-2005年分离的224株RA对9大类36种常用药物的耐药性进行了检测,使用WHONET 5.3软件对结果进行分析。结果表明RA临床株对氨曲南、头孢吡肟、青霉素G、苯唑西林、头孢他啶和复方新诺明耐药率最高,分别高达87.8%、64.3%、86.9%、88.6%、75.9%和79.2%,而对阿米卡星、头孢哌酮、亚胺培南和新霉素的敏感率最高,依次为85.1%、70.6%、95%和61.8%,耐药率低于10%。比较耐药谱发现R.anatipestifer耐药谱以10～29种药物为主,即呈现泛耐药现象。比较耐药率变化规律发现除氨曲南、大观霉素、头孢哌酮和哌拉西林外,RA临床株对其它药物耐药率并无规律可寻,这可能是由于各地区血清型和用药习惯不同造成分离的RA耐药性不同有关,因此在用药前应先进行药物筛选。2.抽取72株耐β-内酰胺类药物的菌株,建立快速脉冲电泳分型方法,经限制性内切酶SmaⅠ酶切,将R.anatipestifer基因组切成6-19条带。以80%相似性为界将多重耐药菌株分为60个脉冲电泳型,与耐药谱型相比两者没有相关性。本实验建立的快速样品处理方法,可以将菌体蛋白消化时间缩短为1.5h,从菌体沉淀到获得脉冲电泳图片整个过程可以在30h之内完成,经重复性实验,证明该方法快速稳定,重复性好,解决了使用脉冲电泳方法在R.anatipestifer流行病学和遗传学的研究中出现的耗时长的确定。3.通过对R.anatipestifer携带1、2和3型整合子检测和sul1、sul2和sul3基因检测,结果表明,共检测出4种结构的1型整合子:aadAl1-qacE△1-sul1(17株),dhffⅠ-aadA2-qacE△1-sul1(1株),sul(29株)和非典型整合子(2株),1型整合子携带率为61.11%,有5株同时携带2种1型整合子,其中4株同时携带aadAl1-qacE△1-sul1和sul1,1株同时携带dhfrⅠ-aadA2-qacE△1-sul1和sul1,所有的菌株均未检测到2型和3型整合子。通过sul基因检测发现,有53株RA携带sul基因,其中50株只携带sul1基因,2株同时携带sul1和sul2基因,1株只携带sul2基因,所有的菌株均未检测到sul3基因,sul基因携带率为73.61%,这与RA临床株对磺胺类药物耐药率为88.89%相接近,因此可以推断携带sul基因是RA临床株耐磺胺类药物药主要原因之一。通过整合子检测得出25%的RA临床株携带aadA基因,耐药泵表型检测得出65.28%的菌株携带有耐药泵,比较CCCP作用前后RA对链霉素MIC值的变化得出RA对氨基糖苷类药物的耐药性主要由整合子携带aadA基因和耐药泵共同作用引起。4.经PCR检测,四环素耐药基因tetC携带率为16.67%,其中1株同时也携带tetA基因;tetM基因携带率为11.11%,其中1株同时也携带tetC基因。将K-B纸片法和MIC实验结果对比发现在耐药率上相差很大,可能是由于所采用的判断标准不适于R.anatipestifer,通过建立荧光染料定量RT-PCR法对R.anatipestifer四环素耐药基因mRNA水平的研究和MIC实验结果,认为R.anatipestifer对四环素类药物的抗药性与携带tet基因有关,但是也存在其它的耐药机制。5.选取5株氧氟沙星耐药株,通过CCCP耐药泵表型检测,左氧氟沙星和新喹诺酮药物CO-06NF诱导,抽提外膜蛋白和全菌蛋白电泳,SSCP对GyrA基因诱导前后突变检测,结果显示5株菌有4株携带耐药泵,对诱导成功的1株菌株外膜蛋白和全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳后发现,左氧氟沙星诱导耐药株外膜蛋白内有变化,CO-06NF诱导耐药株在接近21KD处的一条蛋白质条带表达量明显增加,全菌蛋白电泳发现,左氧氟沙星诱导耐药株和CO-06NF诱导耐药株在45KD处有一条共同条带表达量高于诱导前。而SSCP电泳检测GyrA基因发现诱导前后没有变化,这株细菌耐药泵检测为阳性,因此由结果推测R.anatipestifer对喹诺同类药物的耐药主要由耐药泵引起,而且最先发生突变耐药基因可能不是GyrA基因。6.72株临床株对苯唑西林、青霉素G和头孢吡肟耐药率分别为100%、97.22%和95.83%,对头孢噻肟的耐药率也达到70.83%,MIC检测结果与纸片法检测结果相一致。加入CCCP后,RA对苯唑西林、青霉素G、头孢噻肟和头孢吡肟的耐药率依次下降为91.67%、55.56%%、21.97%和44.44%,MIC值最低可降至处理前的1/2048。而β-内酰胺酶表型和基因型检测均为阴性,说明不存在β-内酰胺酶耐药机制,而耐药泵介导耐药是R.anatipestifer主要原因之一,通过头孢吡肟诱导试验,和外膜蛋白电泳发现在14.4～20KD和45KD处各有两条条带发生缺失。诱导株加入CCCP后,MIC值只下降为原来一半,说明可能这株诱导株对头孢吡肟的耐药性是由膜通透性降低引起,因此R.anatipestifer耐药株存在耐药泵出机制,推测也存在膜通透性降低引起的耐药机制。