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血液病病人接受化疗后，往往会伴有严重的感染甚至诱发第二肿瘤。作为中枢免疫系统的重要器官，胸腺在化疗中也会受到严重的损伤从而影响机体的免疫环境平衡与稳定。研究表明间充质干细胞(MSCs)可以促进胸腺上皮细胞的增殖和修复，从而进一步达到修复胸腺组织的目的。本论文的目的主要是研究人脂肪源间充质干细胞(hADMSCs)对化疗后所致的BABL/C小鼠损伤胸腺的修复作用。我们以地塞米松磷酸钠注射液(Dex)来制造化疗模型，成功获得化疗所导致的小鼠胸腺损伤模型后，给予体外原代培养鉴定后的一定细胞数量的hADMSCs进行细胞治疗，在不同时间点分别检测小鼠胸腺病理结构和功能及外周免疫指标的改变。另外用带有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒转染hADMSCs进行细胞的示踪研究，并检测hADMSCs及治疗前后小鼠胸腺组织中与胸腺发育及增殖相关的细胞因子的表达水平的变化以探讨修复的机制。本研究论文分为三部分：
第一部分:人脂肪源间充质干细胞(hADMSCs )的原代培养鉴定及BALB/C小鼠化疗模型的构建
目的：
人脂肪源间充质干细胞的原代分离培养及鉴定为细胞治疗准备细胞来源，选择合适的化疗药物及药物剂量构建化疗所致的胸腺损伤的小鼠模型。
方法：
收集健康供者脂肪组织，按照原代间充质干细胞细胞培养的方法消化、分离，以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，约1周时细胞可达到对数生长期，继续传代培养，选取P4代细胞流式细胞仪检测细胞表面标志，诱导液诱导细胞成脂成骨以鉴定其分化能力。分别给予小鼠地塞米松磷酸钠、高剂量环磷酰胺(CTX)、低剂量环磷酰胺化疗造模，观察小鼠的一般情况和胸腺组织病理结构的变化。
结果：
1.hADMSCs可进行体外原代培养，原代细胞形态符合间充质干细胞特点，呈梭形，贴壁生长，10天左右细胞融合达到70%-80%，呈涡旋状生长，可稳定传代多次。
2.P4代hADMSCs表达CD44、CD105和CD29,不表达CD34和CD45，具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力。
3.以地塞米松磷酸钠20mg/kg给予BALB/C小鼠腹腔注射制造动物模型，BABL/C小鼠的胸腺病理损伤明显，且呈弥漫性改变，造模成功率高。
结论：
hADMSCs可以进行原代体外培养并稳定传代，P4代细胞表型表达及成脂肪细胞、成骨细胞分化能力鉴定符合以往的研究报道及间充质干细胞的生物学特点。以地塞米松磷酸钠注射液20mg/kg制造动物模型，BABL/C小鼠胸腺病理损伤明显，且造模成功率高。
第二部分：人脂肪源间充质干细胞对BALB/C小鼠化疗损伤胸腺的修复作用
目的：
研究hADMSCs对BALB/C小鼠化疗所致胸腺损伤的结构和功能的修复作用以及胸腺修复后对外周免疫系统的影响。
方法：
80只BALB/C小鼠分为四组，分别为正常组、模型对照组、治疗组和未治疗组，每组20只，分别于hADMSCs细胞治疗后第3天、第7天、第10天及第14天取材，每组每个时间点取5只BALB/C小鼠，分别取胸腺制作冰冻切片进行HE及免疫荧光染色，取胸腺，脾脏及外周血制备单细胞悬液，应用流式细胞技术分别进行T细胞亚群比例及Treg的比例进行检测。取脾脏组织进行聚合酶链式反应(PCR)检测T细胞受体删除环(TRECs)相对表达含量。
结果：
1.hADMSCs治疗模型小鼠后，第3天和第7天时，治疗组小鼠胸腺病理结构较未治疗组胸腺明显恢复，HE染色皮髓质分布清晰，胸腺细胞及网状上皮细胞数量和形态接近于正常，免疫荧光提示皮、髓质网状上皮细胞特异性标记物角蛋白8(K8)及角蛋5(K5)分布基本正常，且第7天时治疗组的荧光强度较未治疗组明显增强。
2.hADMSCs治疗后第3天时，治疗组BALB/C小鼠胸腺中CD4+CD8-及CD8+CD4-的T细胞的比例高于未治疗组，存在统计学意义。脾脏细胞中治疗组TRECs相对表达量高于未治疗组，存在统计学意义。其他时间点无明显差别。
3.第3天时，hADMSCs治疗组中外周血T细胞亚群的比值高于未治疗组，存在统计学意义。治疗组外周血Treg比例明显高于未治疗组，具有统计学意义。其他时间点在外周血及脾脏中无明显差别。
结论：
hADMSCs对化疗损伤的小鼠胸腺的结构和功能均具有修复作用，对外周免疫系统有所改善。
第三部分：人脂肪源间充质干细胞对化疗损伤胸腺的修复机制的研究
目的：
研究hADMSCs对小鼠化疗所致损伤胸腺修复的机制。
方法：
取P4代hADMSCs作为治疗细胞，慢病毒转染hADMSCsP4代细胞，感染复数MOI为50，待转染成功后，以2×105细胞/只腹腔注射给化疗损伤胸腺的BALB/C小鼠模型及正常小鼠，注射后48小时取小鼠胸腺组织制成冰冻切片，DAPI染核，荧光显微镜观察hADMSCs是否到达受损胸腺组织。PCR技术检测hADMSCs中细胞因子KGF、Ghrelin及IL-7的表达。在hADMSCs细胞治疗后第3天时，取正常组、治疗组及未治疗小鼠胸腺组织适量，通过PCR及ELISA的方法检测细胞因子KGF,Ghrelin的mRNA及蛋白水平的表达。
结果：
1．在化疗模型BALB/C小鼠胸腺冰冻切片里可以找到带绿色荧光蛋白标记的hADMSCs，而正常小鼠胸腺切片未找到。
2．通过PCR的方法检测到hADMSCs表达细胞因子KGF,Ghrelin，但几乎不表达IL-7。
3.细胞治疗后第3天，治疗组小鼠胸腺组织中KGF,Ghrelin因子的mRNA表达水平及蛋白表达水平均高于未治疗组，且存在统计学意义。
结论：
hADMSCs可以到达损伤的胸腺组织，表达KGF、Ghrelin因子。治疗组小鼠胸腺组织中的KGF、Ghrelin细胞因子的表达水平高于未治疗组。hADMSCs可能通过分泌KGF、Ghrelin细胞因子对胸腺进行修复。
总之，hADMSCs可以进行体外培养，并且稳定传代至十余代，其符合MSCs的表型表达并具有成脂肪成骨细胞的分化潜能。Dex20mg/kg的化疗给药模式对小鼠胸腺损伤明显，造模成功率高。hADMSCs对化疗损伤的小鼠胸腺的结构和功能均有修复作用，对化疗后外周免疫系统的恢复也有所改善。hADMSCs可以到达小鼠化疗损伤的胸腺，并且表达KGF,Ghrelin,几乎不表达IL-7。治疗后第3天时，治疗组BALB/C小鼠胸腺组织中KGF,Ghrelin的mRNA及蛋白的表达水平高于未治疗组小鼠胸腺组织。hADMSCs可能是通过旁分泌作用来修复损伤的胸腺的。
第一部分:人脂肪源间充质干细胞(hADMSCs )的原代培养鉴定及BALB/C小鼠化疗模型的构建
目的：
人脂肪源间充质干细胞的原代分离培养及鉴定为细胞治疗准备细胞来源，选择合适的化疗药物及药物剂量构建化疗所致的胸腺损伤的小鼠模型。
方法：
收集健康供者脂肪组织，按照原代间充质干细胞细胞培养的方法消化、分离，以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，约1周时细胞可达到对数生长期，继续传代培养，选取P4代细胞流式细胞仪检测细胞表面标志，诱导液诱导细胞成脂成骨以鉴定其分化能力。分别给予小鼠地塞米松磷酸钠、高剂量环磷酰胺(CTX)、低剂量环磷酰胺化疗造模，观察小鼠的一般情况和胸腺组织病理结构的变化。
结果：
1.hADMSCs可进行体外原代培养，原代细胞形态符合间充质干细胞特点，呈梭形，贴壁生长，10天左右细胞融合达到70%-80%，呈涡旋状生长，可稳定传代多次。
2.P4代hADMSCs表达CD44、CD105和CD29,不表达CD34和CD45，具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力。
3.以地塞米松磷酸钠20mg/kg给予BALB/C小鼠腹腔注射制造动物模型，BABL/C小鼠的胸腺病理损伤明显，且呈弥漫性改变，造模成功率高。
结论：
hADMSCs可以进行原代体外培养并稳定传代，P4代细胞表型表达及成脂肪细胞、成骨细胞分化能力鉴定符合以往的研究报道及间充质干细胞的生物学特点。以地塞米松磷酸钠注射液20mg/kg制造动物模型，BABL/C小鼠胸腺病理损伤明显，且造模成功率高。
第二部分：人脂肪源间充质干细胞对BALB/C小鼠化疗损伤胸腺的修复作用
目的：
研究hADMSCs对BALB/C小鼠化疗所致胸腺损伤的结构和功能的修复作用以及胸腺修复后对外周免疫系统的影响。
方法：
80只BALB/C小鼠分为四组，分别为正常组、模型对照组、治疗组和未治疗组，每组20只，分别于hADMSCs细胞治疗后第3天、第7天、第10天及第14天取材，每组每个时间点取5只BALB/C小鼠，分别取胸腺制作冰冻切片进行HE及免疫荧光染色，取胸腺，脾脏及外周血制备单细胞悬液，应用流式细胞技术分别进行T细胞亚群比例及Treg的比例进行检测。取脾脏组织进行聚合酶链式反应(PCR)检测T细胞受体删除环(TRECs)相对表达含量。
结果：
1.hADMSCs治疗模型小鼠后，第3天和第7天时，治疗组小鼠胸腺病理结构较未治疗组胸腺明显恢复，HE染色皮髓质分布清晰，胸腺细胞及网状上皮细胞数量和形态接近于正常，免疫荧光提示皮、髓质网状上皮细胞特异性标记物角蛋白8(K8)及角蛋5(K5)分布基本正常，且第7天时治疗组的荧光强度较未治疗组明显增强。
2.hADMSCs治疗后第3天时，治疗组BALB/C小鼠胸腺中CD4+CD8-及CD8+CD4-的T细胞的比例高于未治疗组，存在统计学意义。脾脏细胞中治疗组TRECs相对表达量高于未治疗组，存在统计学意义。其他时间点无明显差别。
3.第3天时，hADMSCs治疗组中外周血T细胞亚群的比值高于未治疗组，存在统计学意义。治疗组外周血Treg比例明显高于未治疗组，具有统计学意义。其他时间点在外周血及脾脏中无明显差别。
结论：
hADMSCs对化疗损伤的小鼠胸腺的结构和功能均具有修复作用，对外周免疫系统有所改善。
第三部分：人脂肪源间充质干细胞对化疗损伤胸腺的修复机制的研究
目的：
研究hADMSCs对小鼠化疗所致损伤胸腺修复的机制。
方法：
取P4代hADMSCs作为治疗细胞，慢病毒转染hADMSCsP4代细胞，感染复数MOI为50，待转染成功后，以2×105细胞/只腹腔注射给化疗损伤胸腺的BALB/C小鼠模型及正常小鼠，注射后48小时取小鼠胸腺组织制成冰冻切片，DAPI染核，荧光显微镜观察hADMSCs是否到达受损胸腺组织。PCR技术检测hADMSCs中细胞因子KGF、Ghrelin及IL-7的表达。在hADMSCs细胞治疗后第3天时，取正常组、治疗组及未治疗小鼠胸腺组织适量，通过PCR及ELISA的方法检测细胞因子KGF,Ghrelin的mRNA及蛋白水平的表达。
结果：
1．在化疗模型BALB/C小鼠胸腺冰冻切片里可以找到带绿色荧光蛋白标记的hADMSCs，而正常小鼠胸腺切片未找到。
2．通过PCR的方法检测到hADMSCs表达细胞因子KGF,Ghrelin，但几乎不表达IL-7。
3.细胞治疗后第3天，治疗组小鼠胸腺组织中KGF,Ghrelin因子的mRNA表达水平及蛋白表达水平均高于未治疗组，且存在统计学意义。
结论：
hADMSCs可以到达损伤的胸腺组织，表达KGF、Ghrelin因子。治疗组小鼠胸腺组织中的KGF、Ghrelin细胞因子的表达水平高于未治疗组。hADMSCs可能通过分泌KGF、Ghrelin细胞因子对胸腺进行修复。
总之，hADMSCs可以进行体外培养，并且稳定传代至十余代，其符合MSCs的表型表达并具有成脂肪成骨细胞的分化潜能。Dex20mg/kg的化疗给药模式对小鼠胸腺损伤明显，造模成功率高。hADMSCs对化疗损伤的小鼠胸腺的结构和功能均有修复作用，对化疗后外周免疫系统的恢复也有所改善。hADMSCs可以到达小鼠化疗损伤的胸腺，并且表达KGF,Ghrelin,几乎不表达IL-7。治疗后第3天时，治疗组BALB/C小鼠胸腺组织中KGF,Ghrelin的mRNA及蛋白的表达水平高于未治疗组小鼠胸腺组织。hADMSCs可能是通过旁分泌作用来修复损伤的胸腺的。