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目的:
1)探讨马兜铃酸钠盐(AA-Na)对肾小管上皮细胞的损伤作用机制。
2)探讨温阳活血方含药血清的干预作用机理。
方法:
1)光镜、电镜下观察不同浓度AA-Na(0、5、10、20、40μg·ml-1)刺激下大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)形态及超微结构的变化。
2)MTT法检测马兜铃酸(AA)对NRK-52E细胞增殖的影响,流式细胞仪检测NRK-52E细胞的凋亡指数。
3)免疫细胞化学法观察NRK-52E细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的变化情况。
4)ELISA法检测NRK-52E细胞分泌Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)的变化情况。
5)本研究采用中药血清药理学和体外细胞培养的实验方法,运用Real-Time PCR法检测含药血清对NRK-52E细胞表达转化生长因子(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素-1(ET-1)、骨形态形成蛋白(BMP-7)及凋亡蛋白(Caspase-3)的影响。
6)ELISA法检测含药血清干预下,NRK-52E细胞分泌COL-Ⅰ的变化情况。
结果:
1)AA-Na刺激NRK-52E细胞24h后,细胞间隙增宽,AA-Na10μg·ml-1及20μg·ml-1组少数细胞拉长为梭形,线粒体肿胀,AA-Na40μg·ml-1组核膜卷曲增厚,核固缩,染色质着边。
2)AA-Na浓度在5μg·ml-1、10μg·ml-1时,对NRK-52E的增殖无明显影响(P>0.05),当AA-Na浓度大于10μg·ml-1时,吸光度值显著降低(P<0.01),呈剂量依赖性,AA-Na在5、10μg·ml-1浓度时无明显促细胞凋亡作用(P>0.05),20μg·ml-1 AA-Na有显著促细胞凋亡作用(P<0.05),尤其以40μg·ml-1 AA-Na组最为明显(P<0.01),即10μg·ml-1 AA-Na不影响细胞增殖,也无明显促凋亡作用,故用于本实验。随着马兜铃酸浓度的升高,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达逐渐增强。40μg·ml-1 AA-Na浓度作用后,大量细胞肿胀,坏死。
3)AA-Na(10μg·ml-1)刺激细胞12,24、48h后,随时间的延长,细胞外基质COL-Ⅰ表达均上调(P<0.01),呈时间依赖性。
4)与正常对照组比较,AA-Na组大鼠近端肾小管上皮细胞TGF-β1 mRNA表达上调(p<0.05),VEGF m RNA表达显著下调(P<0.01),ET-1 mRNA的表达显著上调(P<0.01),BMP-7 mRNA表达水平显著降低(P<0.01),Caspases-3 mRNA表达水平显著上调(P<0.01),与AA-Na组比较,温阳活血方组TGF-β1 mRNA表达下调(p<0.05),VEGF m RNA表达显著上调(P<0.01),BMP-7 mRNA表达水平显著上调(P<0.01),Caspases-3 mRNA表达水平显著下调(P<0.01)。
5)与正常对照组比较,AA-Na组COL-ⅠmRNA表达水平显著高于正常对照组(P<0.01),与AA-Na组比较,温阳活血方组、氯沙坦组COL-Ⅰ mRNA表达水平均明显下调(P<0.01)。
结论:
1)马兜铃酸可直接损伤肾小管上皮细胞,促进其转分化,坏死及凋亡。
2)10μg.ml-1 AA-Na作用于细胞24h,无明显促增殖作用,也无明显促凋亡作用。
3)温阳活血方通过对多种因子的调控,发挥其对马兜铃酸肾毒性的拮抗作用。