论文部分内容阅读
传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)的病原是传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV),其主要侵害3-6周龄家禽法氏囊未成熟的B淋巴细胞,是一种高度接触性、急性、致死性传染病。IBDV的血清型可分为I和II型,然而只有血清I型会导致雏鸡发病。血清I型病毒发生过两次比较大的变异,产生了三种毒株:经典毒、变异株和超强毒株。超强毒可以导致雏鸡死亡而弱毒则不能导致雏鸡死亡,故超强毒株与弱毒株在致病机制上的差异值得深入研究。法氏囊B淋巴细胞可以被传染性法氏囊病强弱毒感染,所以是研究强弱毒差异最理想的细胞模型。有研究报道,鸡的原代法氏囊B淋巴细胞在体外培养易于凋亡。72小时的凋亡率可达到80%以上,但鸡源CD40L能维持并增加B淋巴细胞的存活时间达到数周以上。本研究构建了CD40L功能域的真核表达载体并进行人源密码子优化,用293T细胞进行表达。结果表明CD40L成功表达,并将纯化的CD40L直接添加到法氏囊B淋巴细胞的培养基中,选择不同的时间点分别进行B淋巴细胞形态的观察、活性的检测、细胞调亡的检测以及细胞数量的统计。结果显示添加CD40L以后可以小量地增加细胞数、增强细胞活性、减缓法氏囊B淋巴细胞的凋亡速度,但目前还不能使其在体外长时间培养。为了更好地研究并认识传染性法氏囊病病毒复制的机制,本研究开展了病毒与宿主相互作用的研究。首先利用IBDV多聚蛋白进行免疫沉淀试验,并将疑似条带进行质谱分析,发现其中一个宿主蛋白eEF1α与IBDV多聚蛋白存在相互作用。为了进一步研究eEF1α在IBDV复制以及IBDV强弱毒复制差异中的作用,分别从转录水平和蛋白表达水平检测了等量的IBDV强弱毒感染原代法氏囊B细胞后eEF1α的变化,发现IBDV强弱毒感染促进eEF1α的转录,并且强毒的促进程度高于弱毒,但蛋白的表达水平并没有发生明显的变化。为了研究eEF1α的变化对IBDV复制的影响,筛选获得了针对鸡源eEF1α的有效siRNA,干扰下调DF-1细胞内源的eEF1α后,能够减少IBDV弱毒Gt在DF-1内的病毒蛋白表达,也能降低病毒的TCID50滴度;而干扰下调DT40细胞内源的eEF1α后,能够十分明显地减少IBDV强毒Gx在DT40内的病毒蛋白的表达,也能降低病毒的ELD50滴度。反过来,在DT40细胞中过表达外源eEF1α,能小量增加IBDV强毒VP3蛋白的量。说明IBDV强弱毒的复制均需要宿主蛋白eEF1α的参与。然后利用免疫共沉淀试验发现eEF1α与IBDV强毒的VP3蛋白存在相互作用,但与IBDV弱毒的VP3蛋白不存在相互作用,即eEF1α与强弱毒的相互作用存在差异。激光共聚焦试验进一步证实eEF1α与强毒VP3能够部分共定位。基于序列分析发现强弱毒VP3之间有4个氨基酸的差异(28、226、235、250位)。为了进一步确定eEF1α与Gx-VP3作用的关键位点,将强弱毒VP3进行相互的点突变,再进行免疫共沉淀试验,发现eEF1α与Gx-VP3的作用位点不只一个,因为Gt-VP3向Gx-VP3单一位点的突变均没能被eEF1α沉淀下来,而Gx-VP3的28、235、250突变成相应位点的弱毒氨基酸后被沉淀的条带明显减弱,证明这些位点均与eEF1α的相互作用有关。综上所述,本研究发现传染性法氏囊病强弱毒在与宿主蛋白eEF1α的相互作用上存在差异,并且证明eEF1α能够影响传染性法氏囊病强弱毒的复制。由于eEF1α是翻译延伸因子,故推测eEF1α可能是在病毒蛋白翻译的过程中发挥作用,具体的作用机制还需后续继续探究。