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背景:恶性胶质瘤是颅内最常见的肿瘤,呈侵袭性生长,恶性程度高。多数患者生存期仅能达到12至15个月,5年生存率低于5%[1]。作为一种高度异质性的肿瘤,恶性胶质瘤具有复杂的基因和信号的改变。现阶段对于恶性脑胶质瘤的主要治疗方法是以手术为主,辅以化疗、放疗以及靶向治疗,即便是具有针对性的分子靶向药物,临床试验治疗效果仍不理想[2],这可能与胶质瘤干细胞的存在密切相关。因此,从胶质瘤干细胞的角度探究脑胶质瘤患者生存预后差的潜在机制,为治疗脑胶质瘤、改善预后及提高生存率具有重要的意义。近年研究发现,恶性胶质瘤中存在着表观遗传学调节的异常。表观遗传学调节可以支配脑胶质瘤细胞在致瘤和非致瘤状态之间动态转变。与基因突变不同,表观遗传的改变是可逆的[3,4]。因此,寻找脑胶质瘤表观遗传学关键位点,利用表观遗传学机制进行干预,恢复脑胶质瘤细胞表观遗传学修饰的正常状态,有利于制定新的治疗策略,为脑胶质瘤的治疗和预后提供新的方向。组蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3,HDAC3）是组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）家族第I类成员之一,可以催化组蛋白和其他蛋白质的去乙酰化,参与多种基因的转录调控,在细胞发育和肿瘤中发挥重要的作用[5,6]。RGFP966是近年发现的HDAC3抑制剂,作用靶点为HDAC3,对其它HDAC无有效的抑制作用[7]。文献报道,HDAC3抑制剂RGFP966既可以通过诱导凋亡抑制皮肤T细胞淋巴瘤的增殖[8],也可以通过促进恶性血液肿瘤细胞分化而抑制肿瘤的增殖[9],提示HDAC3在多种肿瘤中表达异常并与肿瘤的发生发展密切相关。本课题组在前期工作中,对自转基因小鼠(h GFAP-Cre+p53L/LPtenL/+)脑胶质瘤自发模型[10]中提取的脑胶质瘤干细胞进行sh RNA表观遗传学文库筛查,发现HDAC3下调能够明显抑制小鼠脑胶质瘤干细胞（Glioma stem cell,GSC）的增殖能力。在脑胶质瘤干细胞异种移植瘤的小鼠模型中,HDAC3抑制剂RGFP966（HDAC3i）能抑制小鼠脑胶质瘤干细胞移植瘤的生长,但仍呈现一定的增长率。有文献证实,白血病抑制因子受体的激活限制了乳腺癌中组蛋白去乙酰化转移酶（HDAC）抑制剂的抗肿瘤效应,因此,推测那些不能被HDAC3i抑制的残留的脑胶质瘤干细胞可能通过某种促生长的基因的乙酰化水平维持异常的自我更新。BRD4是转录和表观遗传调控因子。研究发现,BRD4是BET（Bromodomain and extra terminal domain）家族中一种重要的转录延伸的调节子,可以募集正向转录延伸因子复合体（P-TEFb）,并引起RNA聚合酶II的激活,从而促进癌基因,如c-Myc等的表达。组蛋白的乙酰化需要先被“乙酰化阅读器蛋白”识别,然后才能产生最终的转录结果。BRD4是组蛋白乙酰化所介导的转录过程中所需的“阅读器蛋白”。它具有两个串联的溴结构域（BD1,BD2）,并通过溴结构域识别并结合组蛋白末端乙酰化的赖氨酸位点,参与表观遗传基因的读取和调控[11]。在四种乙酰化标记位点H3K14ac、H3K27ac、H3K122ac和H4K16ac中,BRD4与H3K27Ac位点的结合与非常高的基因活性密切相关。而BRD4选择性抑制剂JQ1（BRD4i）,可与BRD4蛋白的溴结构域竞争性结合,从而取代BRD4蛋白与染色质上的乙酰化赖氨酸的结合,将BRD4置换下来,在包括NUT中线癌、骨肿瘤以及血液系统肿瘤中显示出良好的抗肿瘤效果,并可以显著抑制STAT3信号通路[12,13]。同时,前期工作发现,HDAC3i能够诱导STAT3在酪氨酸705位点的磷酸化,而STAT3通路的激活又与肿瘤的生长密切相关。因此,若能抑制这种激活,有望增强HDAC3i对胶质瘤干细胞的抑制作用,从而进一步提高HDAC3i对脑胶质瘤的治疗效果。而BRD4i能够显著抑制脑胶质瘤干细胞中STAT3信号通路。综上,推测二者联合使用可能会展现出较强的抗肿瘤作用。GLI1是转录因子和Hh信号通路的终端效应因子。GLI1蛋白是Hh信号通路的重要转录因子,能够调节Hh通路的下游基因,在细胞增殖,分化,凋亡和迁移中起着重要作用[14,15]。已有文献证实,成神经母细胞瘤中BRD4的基因组足迹与GLI1占据的那部分重叠,BRD4能够直接调节Gli（Gli1和Gli2）的转录活性[16,17]。GLI1与IL-6启动子结合并调节IL-6的活性和表达来维持活化的STAT3[18]。在此基础上,本研究拟对单独应用BRD4i和HDAC3i以及BRD4i联用HDAC3i之后对脑胶质瘤干细胞增殖、凋亡以及STAT3信号通路的影响进行对比,观察BRD4i联合HDAC3i作用下脑胶质瘤干细胞的变化,进一步验证BRD4i联合HDAC3i治疗脑胶质瘤干细胞的协同效应,分析BRD4i和HDAC3i调节STAT3信号通路的方式,揭示BRD4i和HDAC3i协同抑制脑胶质瘤干细胞的作用机制,寻找脑胶质瘤的新的治疗靶点。目的:1、以GSCs为实验对象,联合BRD4,探究BRD4i联合HDAC3i对脑胶质瘤干细胞生长的影响;2、探究BRD4i联合HDAC3i对脑胶质瘤干细胞联合用药的效果及作用机制。方法:一、联合抑制BRD4与HDAC3对脑胶质瘤干细胞的影响。体外实验:实验分组:阴性对照组、BRD4i或si BRD4组、HDAC3i组、BRD4i联合HDAC3i组。CCK8检测对GSCs细胞活力的影响;细胞生长计数、克隆形成实验检测对GSCs增殖能力的影响;神经球成球实验检测GSCs自我更新的能力;流式细胞术检测GSCs细胞凋亡和细胞周期的变化;TUNEL染色检测GSCs细胞凋亡;q RT-PCR检测细胞凋亡、细胞周期相关基因以及分化标志物的表达变化;免疫荧光检测GSCs相关分化标志物的表达。体内实验:实验分组:阴性对照组、BRD4i组、HDAC3i组、BRD4i联合HDAC3i组。在给药治疗期间,每隔一天观察并测量肿瘤的长度和宽度,称量小鼠体重。给药治疗21天后,将小鼠脱颈处死,对肿瘤体积（V=1/2长×宽2）和小鼠体重进行统计分析。免疫组织化学染色观察对脑胶质瘤干细胞增殖和分化标记物的影响;TUNEL染色检测细胞凋亡;q RT-PCR检测细胞凋亡和周期相关基因以及分化标志物的表达变化;Western-blot分析STAT3以及下游基因蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达。二、联合抑制BRD4与HDAC3抑制恶性脑胶质瘤干细胞生长的作用机制。采用不同浓度的HDAC3i溶液作用于CSC2078细胞。ELISA试剂盒验证HDAC3的活性;CCK8实验检测HDAC3i对CSC2078细胞的影响;Western-blot检测STAT3以及下游基因蛋白水平的变化。利用sh STAT3和HDAC3i作用于CSC2078细胞,Western-blot分析STAT3以及下游基因Bcl-2、Mcl-1蛋白水平的变化;细胞生长计数实验分析细胞的增殖能力;神经球成球实验检测细胞自我更新的能力。不同浓度的BRD4i溶液作用于CSC2078细胞,Western-blot实验检测STAT3、p-STAT3（Tyr705）蛋白表达水平的变化。利用RNA-seq测序分析BRD4i联合HDAC3i抑制脑胶质瘤干细胞生长过程中的关键分子;Western-blot验证对STAT3信号通路的影响;Ch IP分析HDAC3i对GLI1基因启动子处H3K27位点的乙酰化以及GLI1启动子处BRD4的募集情况;ELISA检测IL-6的分泌水平;Ch IP分析GLI1对IL-6的调控作用;Western-blot分析IL-6以及STAT3通路的变化。结果:一、联合抑制BRD4与HDAC3可以有效协同抑制脑胶质瘤干细胞生长体外实验:CCK8检测结果显示,与阴性对照组、BRD4i或si BRD4组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组对GSCs细胞活力的抑制作用最为明显,且呈现出显著的协同效应;细胞生长计数结果表明,与阴性对照组、BRD4i或si BRD4组和HDAC3i组相比,BRD4i或si BRD4联合HDAC3i组GSCs数量明显减少;克隆形成实验证实,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组GSCs所形成的克隆数量最少;神经球成球实验结果显示,与阴性对照组、BRD4i或si BRD4组和HDAC3i组相比,BRD4i或si BRD4联合HDAC3i组GSCs自我更新能力显著降低;流式细胞术结果表明,与阴性对照组、BRD4i或si BRD4组和HDAC3i组相比,BRD4i或si BRD4联合HDAC3i组GSCs发生凋亡的细胞所占的比重最多,且绝大部分细胞发生G1期的细胞阻滞;TUNEL染色结果表明,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组GSCs出现绿色荧光的细胞数量最多,且荧光强度最强;q RT-PCR检测结果显示,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组GSCs促凋亡基因Bim、Bax表达显著上调、抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL表达显著下调,周期相关基因以及分化标志物的表达也发生显著变化;免疫荧光结果显示,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组GSCs中成熟的星型胶质细胞标志物S-100β的增强最为明显。体内实验:对肿瘤大小和小鼠体重进行统计分析,结果显示,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组小鼠肿瘤体积最小,而四组的小鼠体重变化并不存在显著差异;免疫组织化学染色结果发现,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组肿瘤增殖和分化的标记物变化最显著;TUNEL染色检测结果显示,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组发生细胞凋亡比重显著增加;q RT-PCR结果显示,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组促凋亡基因Bim、Bax表达显著上调、抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL表达显著下调,周期相关基因以及分化标志物的表达变化最为显著;Western-blot结果表明,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组磷酸化的STAT3以及下游基因Bcl-2、Mcl-1的蛋白表达受到显著抑制。二、联合抑制BRD4与HDAC3通过GLI1/IL-6/STAT3信号通路诱导脑胶质瘤干细胞周期阻滞和凋亡ELISA试剂盒验证HDAC3i能显著抑制HDAC3的活性;CCK8结果显示HDAC3i对CSC2078细胞活力产生抑制作用,但即使在作用浓度为1u M（HDAC3活性显著降低）时,细胞活力仍在80%以上;Western-blot结果表明HDAC3i能诱导STAT3在705位点的磷酸化以及下游基因Bcl-2、Mcl-1蛋白水平的增加,而利用sh STAT3能显著抑制HDAC3i诱导的STAT3的激活以及Bcl-2、Mcl-1的表达;细胞生长计数实验结果显示,与阴性对照组、HDAC3i组相比,sh STAT3联合HDAC3i组的GSCs细胞数量显著减少;神经球成球实验结果证实,与阴性对照组、HDAC3i组相比,sh STAT3联合HDAC3i组GSCs神经球成球能力受到显著抑制;Western-blot实验结果显示BRD4选择性抑制JQ1（BRD4i）作用于CSC2078细胞之后能引起p-STA T3（Tyr705）蛋白表达水平的不同程度的下降。RNA-seq数据分析显示,与对照组相比,经过HDAC3i处理的GSCs与BRD4i联合HDAC3i处理的GSCs之间存在1294个重叠基因。在1294个基因中,有35个基因在受到HDAC3i诱导后表达上调,而在加入BRD4i之后,表达受到显著抑制。如图5A所示,相对转录水平=log 2（每个基因的倍数变化）。在这种情况下,根据相对转录水平（|BRD4i&HDAC3i|-|BRD4i|+HDAC3i）计算每个基因的协同指数。例如,Gm20661的相对转录水平为-3.829（BRD4i组）,2.205（HDAC3i组）和-1.167（BRD4i&HDAC3i组）,因此Gm20661的协同指数为-0.457（|-1.167|-|-3.829|+2.205）。根据此计算方法,在这35个基因中,GLI1的协同指数是最强的。因此,推测GLI1是BRD4i联合HDAC3i抑制脑胶质瘤干细胞生长过程中的关键分子;Western-blot证实联合抑制BRD4与HDAC3能显著抑制GLI1的表达,而GLI1下调能抑制STAT3信号通路,si GLI1联合HDAC3i能显著抑制STAT3信号通路以及Bcl-2和Mcl-1的表达;Ch IP-q PCR结果表明HDAC3i能增强GLI1基因启动子处H3K27位点的乙酰化水平并在GLI1基因启动子处募集更多BRD4来参与转录;q RT-PCR和Western-blot证实GLI1的下调能抑制IL-6的m RNA水平和蛋白水平,同时,ELISA结果表明si GLI1能减少IL-6的分泌;Ch IP-q PCR结果表明GLI1能与IL-6启动子结合直接调控IL-6的转录;Western-blot结果表明si IL-6能抑制STAT3通路,而这种抑制作用又同时能被外源性的IL-6恢复。结论:1、BRD4i联合HDACi协同抑制胶质瘤干细胞增殖和自我更新,诱导胶质瘤干细胞周期阻滞和凋亡,并诱导其向成熟的星型胶质细胞分化。2、HDACi能够增强GLI1基因组蛋白H3K27位点的乙酰化,激活IL-6/STAT3信号通路,限制了HDACi对于脑胶质瘤干细胞的抑制作用;联合BRD4i后,抑制了GLI1的转录,进一步抑制IL-6/STAT3通路,从而发挥协同抗肿瘤的作用。