榄香烯注射液辅助治疗胶质瘤的网络药理学分析及实验研究

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目的:本研究综合应用网络药理学及生物信息学方法探讨榄香烯注射液辅助治疗胶质瘤的潜在活性成分、分子靶点及相关分子机制,进一步使用胶质瘤细胞U251在细胞和分子水平进行验证,旨在为榄香烯注射液临床辅助治疗胶质瘤提供理论依据。方法:1、以“榄香烯”为检索词,在Pub Chem、TCMSP等公共数据库筛选药物的主要活性化合物并通过Uni Prot数据库获得潜在作用靶点;在疾病数据库中获取胶质瘤发生相关基因,并与榄香烯活性成分的潜在作用靶点取交集以确定共有靶点;String在线网站构建蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI)进行网络可视化分析并将结果导出;借助R应用软件对共有靶点进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)、基因本体论(Gene Ontology,GO)分析;根据蛋白的degree值排名筛选Hub基因与活性化合物进行分子对接验证亲和力大小。借助癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas Program,TCGA)数据库及R应用软件详细分析主要通路的富集基因与胶质瘤患者生存预后之间的联系,并选择特定目的基因进行下一步验证。2、在网络药理学和生物信息学研究的基础上用体外CCK-8细胞增殖实验检测不同浓度β-榄香烯对胶质瘤细胞U251增殖的影响,蛋白免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测不同浓度β-榄香烯对PPAR通路目的蛋白表达水平的影响。采用Graphpad prism 8.0.1、SPSS 25.0软件对实验结果进行统计学分析。结果:1、通过公共数据库得到榄香烯注射液3个主要化学成分(β-榄香烯、γ-榄香烯和δ-榄香烯)和172个潜在作用靶点,将重复靶点去除后剩余92个有效作用靶点;通过疾病数据库获得胶质瘤发生相关基因5770个,并将它们与榄香烯有效靶点取交集最终获得69个共有靶点,主要有5-羟色胺受体2A(5-Hydroxytryptamine Receptor 2A,HTR2A)、前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2)大麻素受体1(Cannabinoidreceptor 1,CNR1)、雄激素受体(Androgen Receptor,AR)、CC族趋化因子受体5(C-C Chemo Kine Receptor-5,CCR5)、大麻素受体2(Cannabinoidreceptor 2,CNR2)、蛋白腺苷A1受体(adenosine A1 receptor,ADORA1)及趋化因子受体3(CXC chemokine receptor 3,CXCR3)等;对共有靶点进行GO富集分析共得到870条注释,其中85条与分子功能有关,20条与细胞成分有关,765条与生物过程有关;KEGG富集分析提示共有靶点主要集中于过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome Proliferator Activated Receptor,PPAR)信号通路、5-羟色胺突触传递、脂质代谢等通路;分子对接表明榄香烯主要活性化合物β-榄香烯与Hub基因均具有较高结合活性。生存分析结果提示蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome Proliferator Activated Receptor alpha,PPARA)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoy Co A Desaturase,SCD)、视黄酸受体γ(Retinoid X Receptor gamma,RXRG)高表达的胶质瘤患者具有较长总生存期,而脂肪酸结合蛋白5(Fatty Acid-Binding Protein 5,FABP5)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma,PPARG)高表达患者生存期则相对较短。2、细胞实验表明,不同浓度β-榄香烯(0μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、150μg/m L)对胶质瘤细胞U251具有不同程度抑制作用(P<0.01),浓度越高抑制作用越明显。Western Blotting结果显示经β-榄香烯处理后可显著增加U251细胞内PPARA、SCD蛋白含量(P<0.01),降低FABP5蛋白含量(P<0.01)。结论:1、榄香烯注射液发挥辅助治疗胶质瘤的作用成分有β-榄香烯、γ-榄香烯和δ-榄香烯,作用关键靶点主要为HTR2A、PTGS2、CNR1、AR、CCR5、CNR2、ADORA1及CXCR3等。2、主要成分β-榄香烯与Hub基因CCR5、CNR1、CNR2及ADOAR1均表现出良好的结合性能。3、榄香烯发挥治疗作用参与的信号通路主要是PPAR信号通路、5-羟色胺突触传递、脂代谢等途径。4、PPAR信号通路中PPARA、SCD和FABP5含量与胶质瘤患者总生存期存在一定关联。β-榄香烯可抑制胶质瘤细胞U251增殖,可能通过影响PPAR信号通路来增加PPARA、SCD蛋白含量和降低FABP5蛋白水平等。
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