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研究目的无患子(Sapindus mukorossi Gaertn.)为无患子科(Sapindaceae)无患子属(Sapindus)的一种落叶大乔木,又称为木患子、油患子、肥皂树、洗手果树等,最早记载于《本草纲目》,具有清热祛痰、消积杀虫的功效。无患子果皮中含有丰富的倍半萜苷和三萜皂苷类成分,具有很强的表面活性作用,是天然的非离子型表面活性剂,自古以来人们就有将其浸泡液用来洗头、沐浴的习惯。作为一种优良的绿色天然洗涤用品原料,无患子正在日益受到广泛的关注。然而,当前对于无患子果皮生物活性物质基础的表征研究很少,由于化学成分复杂、种类众多、母核结构相近等因素,造成了难以实现复杂成分鉴别和精细结构区分的困境,这些问题同样普遍存在于其它中药的化学成分分析中,给中药质量标准、药理药效以及药物代谢等研究带来了巨大的挑战。同时在工业上,无患子皂苷纯化工艺存在耗能高、转化率低、杂质污染、原成分破坏严重等问题,造成了极大的资源浪费,严重制约了无患子资源的深度开发利用。因此,本课题进行了如下研究:优化无患子果皮中化学成分表征的质谱条件,建立一套比较完整的中药复杂和痕量成分表征策略,为今后液质联用技术分析中药化学成分提供参考,建立大孔树脂纯化无患子皂苷的工艺,并初步评价无患子皂苷对细菌和真菌的抑制活性,为广谱新型中药抗菌药物以及无患子洗护产品的开发等研究奠定基础。研究方法1优化超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱联用仪器(UPLC-LTQ Orbitrap MS)分析无患子果皮中化学成分的质谱条件,分别对离子模式、流动相添加剂、数据依赖性二级扫描离子数目(TOPN)、碰撞诱导解离(CID)和高能量碰撞诱导解离(HCD)方式以及碰撞能量等因素进行考察优化。2基于UPLC-LTQ Orbitrap MS技术建立一套较为完整的无患子果皮中复杂成分和痕量成分表征策略。实验采用多种数据采集和挖掘策略进行质谱分析:采用常规的数据依赖性(data-dependentacquisistion,DDA)采集技术,根据常春藤型皂苷元、齐墩果酸等标准品的裂解规律和特征碎片离子进行快速筛查;对于复杂成分中难以实现二级碎片信息检测的低丰度目标组分,采用母离子列表(Parention list,PIL)采集技术,选择特定母离子进行MSn质谱分析;对于CID裂解方式无法精细区分的母核结构相近化合物,则采用HCD裂解方式进行高分辨和高精度的二级扫描,实现对低质量碎片信息的检测;对于无患子果皮中未报道的新成分,采用质谱数据的计算机智能计算(In silico)技术,对海量质谱数据进行深度的分析和挖掘,整合Mass Frontier的FISH和MS Tree Match技术用于无患子果皮中可能存在的新成分的高通量筛查,并对新成分进行HCD碎裂验证,提高预测的准确性。3结合前期研究,确定无患子皂苷类成分的主要组成为常春藤型三萜皂苷。因此,首先采用酸水解的方法获取无患子皂苷的水解苷元常春藤皂苷元,进而运用高效液相(HPLC)测定常春藤皂苷元的含量,并以此为考察指标,采用响应面法优化吸附和解吸条件,建立大孔树脂纯化无患子皂苷的工艺。4采用滤纸片扩散法(K-B)进行微生物敏感性实验,通过测量无患子皂苷对供试菌种(5种细菌和2种真菌)抑菌圈直径的大小来评价其抑菌活性,初步筛选出敏感菌,进而采用连续稀释法测定无患子皂苷对敏感菌的最小抑菌浓度(MIC)。结果与结论1优化了 UPLC-LTQ Orbitrap MS分析无患子果皮中化学成分的质谱条件,实验结果表明:在负离子模式下,无患子果皮中的倍半萜苷和三萜皂苷类成分易于形成准分子离子[M-H]-,单一且易于辨认;在流动相中加入不同的添加剂,绝大部分准分子离子峰的离子强度会不同程度的增加,并且不同的添加剂对不同化合物电喷雾电离(ESI)的影响是不同的;在0.1%FA条件下,9种准分子离子峰的离子强度均有不同程度的增加;TOP3、TOP5、TOP10、TOP15比TOP2的二级碎片离子信息分别提高了19.77%、42.03%、64.03%、72.56%,而比TOP2的一级碎片离子信息分别减少了 17.69%、37.45%、58.48%、66.82%。其原因是随着TOPN数量的增加,一级质谱中更多的母离子进行了二级裂解,而扫描速度会相对变慢,导致同一时段内其它共流出成分的质谱信息丢失;CID裂解方式可以提供更丰富的一级、二级质谱信息,而HCD裂解方式可以提供高质量精度和高分辨率,提高化合物鉴定的准确性,但也会因此增加扫描时间,减慢扫描速度;CID、HCD碰撞能量分别选择85、105单位时,可以确保母离子进行有效裂解,产生丰度较强的特征离子。2运用UPLC-LTQ Orbitrap MS技术整合多种数据采集、挖掘策略,对无患子果皮中的化学成分进行系统分析,共鉴别出62个化合物。首先,采用常规的DDA-MS2采集方法,根据常春藤型皂苷元、齐墩果酸等标准品的裂解规律和特征碎片离子进行快速筛查,共鉴别出33种化合物;采用PIL-MS2、PIL-MS3和HCD高能碰撞方法,实现了18个母核结构相近化合物的精细区分和结构鉴别;采用MassFrantier软件进行数据库比对和质谱碎片预测,共推测出11种无患子果皮中未报道的新成分。3采用响应面法建立了大孔树脂纯化无患子皂苷的工艺,研究结果表明:D101型大孔树脂相较于AB-8、DA201、HPD600、DM-130、NKA-9型大孔树脂,对无患子皂苷同时具有较好的吸附和解吸性能;确定了 D101大孔树脂富集无患子皂苷工艺的最佳吸附条件为上样液浓度205 g·L-1,上样流速1.0 BV·h-1,上样液pH值为6.0;最佳解吸条件为77%乙醇洗脱,洗脱流速1.0 BV·h-1,洗脱剂用量5.0 BV。4通过K-B法测定无患子皂苷对5种细菌、2种真菌的抑菌活性,实验结果表明:无患子皂苷对大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、白色念珠菌3种常见的皮肤致病菌具有很好的抑菌效果,抑菌圈直径由大到小依次为乙型副伤寒沙门菌>大肠埃希菌>白色念珠菌,但对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌以及黑曲霉菌无抑菌活性作用。采用连续稀释法测定无患子皂苷对敏感菌的MIC值,实验结果表明:无患子皂苷对大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、白色念珠菌的MIC值分别为5.63mg/ml、11.25mg/ml、5.63mg/ml。无患子皂苷对真菌(白色念珠菌)和细菌(大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌)均具有较强的抑菌活性,并且对革兰氏阴性菌(大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌)的抑菌活性强于革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌)。