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新城疫(Newcastle Disease,ND)是一种急性、烈性呼吸道传染病,是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引发的禽类疫病,严重威胁了养禽业的发展,已被世界动物卫生组织列为必须通报的疫病。NDV是具有囊膜包裹的单股负链RNA病毒,其基因组能编码六个结构蛋白和两个非结构蛋白。其中,核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)是NDV基因组中表达量最多的结构蛋白。NP蛋白与磷蛋白(phosphate protein,P)、大分子聚合酶蛋白(large protein,L)和病毒核酸共同形成病毒复制的基本单元,核糖核蛋白复合体(ribonucleoprotein complex;RNP)。NP蛋白还具备影响病毒毒力、介导细胞免疫应答和引发自噬等功能。这些信息表明NP是一个多功能蛋白。然而,目前关于NP蛋白是通过哪些宿主蛋白发挥作用的尚无相关报道,为了揭示NP蛋白发挥相关功能的分子机制,本文主要从以下四个方面展开研究:(1)为了验证NP蛋白对NDV复制的影响,构建了NP的真核表达载体,并验证其能在DF-1细胞中正常表达。然后在DF-1细胞中过表达NP蛋白,通过Q-PCR、蚀斑和Western blot的方法检测病毒含量,结果表明在DF-1细胞中过表达NP蛋白能够促进病毒复制。为进一步研究NP蛋白促进病毒复制的机制,通过Q-PCR检测干扰素IFNα、IFNβ、IFNγ的表达量,表明NP蛋白能抑制干扰素的表达。这些结果说明NDV的NP蛋白可能通过拮抗干扰素,从而促进病毒复制。(2)为了探究NP蛋白与哪些宿主因子互作调控病毒的复制,将NP基因克隆至pGBKT7载体上,经过自激活验证和毒性检测合格后,以pGBKT7-NP为诱饵筛选鸡胚成纤维细胞cDNA酵母文库,最终获得包含PIAS4(Protein inhibitor of activated STAT4)和PSMA7(Proteasome subunit alpha type 7)等共20个与NP蛋白相关的宿主蛋白。(3)为了探索PIAS4与NP蛋白的关系,在DF-1细胞中过表达NP蛋白,通过Q-PCR检测发现NP蛋白可抑制内源性PIAS4的表达。然后在DF-1细胞中分别过表达PIAS4和用siRNA敲低内源性PIAS4,通过Q-PCR、蚀斑和Western blot的方法检测病毒含量,结果表明在DF-1细胞中PIAS4能够抑制病毒复制。为进一步研究PIAS4发挥抗病毒功能的机制,通过VSV感染实验和Q-PCR检测过表达PIAS4后细胞上清或细胞中干扰素的含量,发现PIAS4可能通过促进干扰素的表达从而抑制病毒复制。(4)为了验证PSMA7的作用,构建了PSMA7的真核表达载体,并验证其能在DF-1细胞中正常表达。然后,在DF-1细胞中分别过表达PSMA7和用siRNA敲低内源性PSMA7,通过Q-PCR、蚀斑和Western blot的方法检测病毒含量,结果表明在DF-1细胞中PSMA7能够抑制病毒复制,而且在DF-1细胞中过表达NP蛋白会抑制内源性PSMA7的表达量。然而通过VSV感染实验和Q-PCR检测干扰素含量的结果表明PSMA7不通过干扰素信号通路发挥抗病毒功能。综上所述,NDV的NP蛋白能通过与PIAS4和PSMA7这两个宿主蛋白互作,并下调这两个蛋白的表达,促进病毒的复制。