细胞衰老(Cell senescence)是处于活性生长状态的细胞脱离细胞周期且不可逆的丧失增殖能力后所进入的一种生长停滞的相对稳定状态,是正常细胞的必然归宿,这种现象在生物体中是普遍存在的。细胞衰老主要分为复制性衰老与胁迫诱导的早熟性衰老,本研究则重点讨论细胞复制性衰老。细胞在复制性衰老过程中会发生许多变化,如细胞生长速度减缓、细胞周期阻滞、端粒缩短、DNA损伤,但是其中最重要的变化就是端粒缩短,端粒缩短被认为是DNA复制性衰老的根本原因。目前发现的能够阻滞细胞复制性衰老、防止端粒缩短促进端粒延长的细胞大多为肿瘤细胞与干细胞,其延长端粒的机制主要有两种:(1)依赖延长端粒的酶即端粒酶来延长端粒;(2)通过ALT途径延长端粒,其中ALT途径主要发生于一些缺乏端粒酶但表达hTR的细胞中,它们能通过重组的方式延长端粒,而表达端粒酶的细胞则主要依靠端粒酶去延伸端粒。调控端粒酶活性的方式有许多种,可以在转录或翻译水平调控hTERT、hTR、Dyskerin等端粒酶复合体的组分,也可以通过调控端粒酶的组装而调控端粒酶。本研究发现细胞核仁内存在一种蛋白—GAB,它就是通过调控端粒酶组装而调控端粒酶活性,最终调控端粒长度导致细胞复制性衰老。目前的研究对于端粒酶组装的分子机制阐述得不够清晰,新的调控蛋白与调控机制有待发现,其在细胞复制性衰老中的功能和意义有待明确。我们实验室前期在研究GAB基因时发现,在敲低GAB的稳定细胞系中,随着传代次数的增加,细胞生长速度明显减缓,且细胞逐渐变大变扁平,因此,我们猜测细胞可能发生了衰老。于是我们在多种端粒酶阳性细胞中敲低GAB后测定细胞生长发现,细胞生长速度都有减缓,但是在端粒酶阴性的U2OS细胞中过表达GAB或者hTERT或者GAB与hTERT共转都不会改变细胞生长速度。同时我们针对这些端粒酶阳性的肿瘤细胞进行了BrdU掺入实验,发现细胞周期阻滞在了G1/S期;后来我们在MCF-7细胞中构建长期稳定敲低GAB的单克隆细胞系,通过SA-β-Gal染色发现,长期稳定敲低GAB后细胞发生衰老,而长期过表达GAB的细胞却很少衰老;既然GAB与细胞生长、细胞周期以及衰老均有联系,那么GAB是否与DNA损伤相关?我们利用IF检测了DNA损伤的几个标志物(γH2AX、p-ATM、53BP1、p-Chk1、p-Chk2),发现在细胞内这几种标志物均形成了焦点样定位,表明DNA发生了损伤,且通过对γH2AX与HP1α共染发现,发生DNA损伤的细胞即为衰老的细胞。为了验证细胞是否发生复制性衰老,我们通过Southern Blotting实验发现,在MCF-7、HT1080细胞长期敲低GAB后,端粒长度缩短,证明细胞发生复制性衰老。那么,GAB是如何调控端粒长度的呢?我们通过Co-IP、GST Pull-Down、RIP、EMSA等实验技术,发现GAB直接结合hTERT与hTR,进一步研究发现GAB通过其BRCT结构域(311-415)与hTERT的500-900区段直接结合,同时GAB通过hTR介导结合hTERT的234-500区段与Dyskerin,通过其221-322区段结合hTR的60-360区段。GAB与端粒酶主要复合体存在相互作用,那么GAB是否可以调控端粒酶活性?我们在体内与体外通过TRAP实验均证明了GAB能够升高端粒酶活性,其发挥功能的主要区域为BRCT结构域。而且GAB的IP复合体具有较高的端粒酶活性。关于端粒酶活性,最后我们在GAB转基因鼠中也证明了转GAB基因鼠的端粒酶活性明显高于野生型小鼠。接下来我们研究了GAB调控端粒酶活性的具体机制。我们首先利用WB与qRT-PCR技术,发现了GAB不改变hTR、h TERT、Dyskerin的表达,但是通过RIP与GST Pull-Down、His Pull-Down等实验发现了在体内与体外GAB均通过其BRCT结构域促进hTR与hTERT的结合。在细胞内敲低GAB会使端粒酶组装复合体中许多成分的结合发生变化,敲低GAB会抑制Dyskerin与hTR、Dyskerin与hTERT的结合,但不改变负责端粒酶运输的蛋白TCAB1与hTERT的结合。另外,敲低GAB会促进hTERT在核仁的定位。由于端粒酶组装有利于hTERT出核仁,因此,GAB能改变hTERT核仁定位的特性这一发现进一步提示GAB与端粒酶组装相关。目前,已发现的调节hTERT与hTR结合的蛋白因子为一对ATP酶—Pontin与Reptin,通过IP实验与TRAP实验,我们发现GAB与Pontin和Reptin之间不存在相互作用,且GAB调控端粒酶活性与Pontin和Reptin之间也没有依赖关系,所以可以认为GAB参与形成的端粒酶复合体不同于已报道的Pontin、Reptin参与形成的端粒酶复合体。最后,我们检测了p53在GAB对端粒酶调控中所起的作用,首先在ZR75-1细胞中我们通过TRAP实验发现过表达p53可以促进细胞的端粒酶活性,且通过TRAP实验我们还发现了GAB调节端粒酶活性部分依赖p53。通过GST PullDown实验发现,GAB与p53存在直接相互作用。通过RIP实验证明,在HCT116p53+/+细胞中,敲低GAB后可以抑制hTERT与hTR的结合,但在HCT116 p53-/-细胞中,敲低GAB后抑制hTERT与hTR的结合能力丧失。综上所述,我们首次发现了由GAB参与的一个新的端粒酶组装复合体,我们同时解析了GAB在端粒酶复合体中的定位与调节端粒酶组装的机制,以及GAB发挥功能的主要结构域。此外,我们还发现了GAB能调节复制性衰老,这为我们进一步了解端粒酶及细胞复制性衰老奠定了基础。