背景:胞内RNA的质量控制包括了RNA的降解、加工以及流转,目前已有多篇研究表明人体内RNA质量控制的异常与肿瘤的发展、神经退行性疾病以及多种致病性病毒感染相关。对于真核生物而言,其体内RNA质量控制相关核酸酶成分复杂,研究较为困难。古菌被认为是真核生物的进化起源,具有与真核生物类似的DNA复制及修复、RNA转录、降解和翻译等遗传机制,能为真核生物的研究提供简单模型;同时,古菌作为与细菌和真核生物并列的第三种生命进化形式,其在生命进化、遗传代谢、生物地球化学循环及功能应用等方面均具有独特且不可或缺的作用,且与人体共寄生,与人类的疾病发展相关。产甲烷古菌是研究最多且遗传代谢最丰富的古菌代表类群之一,是严格厌氧微生物,可作为解析基础生命过程的模式物种。RNA的加工与降解为细胞内RNA质量控制的核心步骤,协助功能RNA的正确形成、蛋白质的高效翻译及环境响应所需的快速调控。RNA的加工和降解通常由一系列核糖核酸酶(ribonucleases),如5′-3′或3′-5′核酸外切酶及核酸内切酶协同执行。目前关于RNA加工及降解的研究主要集中在真核生物以及细菌中,而古菌中的研究甚少。本实验室前期通过生物信息分析发现β-CASP家族核酸酶—RNase J在古菌中广泛分布并进化保守;进一步通过生化实验发现模式甲烷古菌——Methanolobus psychrophilus R15的RNase J(mpy-RNase J)具有5′-3′外切酶活性,并在其晶体结构的基础上,阐明了其RNA识别、催化及高效的外切连续性等分子机制;发现其可能具有duplex RNA解链新活性,但其解链机制未知。目的:研究Methanolobus psychrophilus R15的β-CASP核酸酶mpy-RNase J的双链RNA解链机制并明确其在RNA流转中的功能。方法:以古菌Methanolobus psychrophilus R15 RNase J(以下称mpy-RNase J)为代表,运用生化活性分析以确认其双链RNA解链活性;通过解析mpy-RNase J与6nt poly(A)RNA的二元复合物结构,并结合突变及生化分析以明确其双链RNA解链活性的分子机制,并分析其在RNA代谢中的功能。结果:通过使用不同类型的双链RNA底物(Gx&Hx),证实了mpy-RNase J具有双链RNA解链活性,并能解开长达40bp的duplex RNA;通过突变其水解活性中心及5’单磷酸结合口袋关键残基,证实其解链活性偶联于其水解活性由RNA水解所释放的能量所驱动;通过解析mpy-RNase J-S247A与6 nt poly(A)的共晶结构,并结合关键残基突变和生化活性分析,我们明确了其双链RNA解链活性的的分子机制:依赖其7 nt单链RNA结合通道处单链RNA底物5′末端的外切水解所释放的能量所推动的RNA快速转位过程中,每1 nt的外切水解循环即可推动双链RNA在RNA通道入口处由古菌LoopsⅠ,Ⅱ及α5,α9共同形成的立体排阻效应而打开双链RNA的互补配对而实现其解链并降解;发现mpy-RNase J的双链RNA解链活性能辅助其降解胞内具复杂二级结构的RNA,包括r RNA,t RNA及m RNA 5′UTR区,提示mpy-RNase J在体内应在这些功能RNA的加工、降解及功能监管中发挥着重要作用;发现细菌同源蛋白sco-RNase J也具有双链RNA解链活性,提示该活性应在RNase J家族蛋白中保守存在,进一步明确mpy-RNase J的双链解链机制——水解推动并依赖RNA通道入口处的排阻效应,与真核5′-3′核酸外切酶Xrn1及RNase II家族蛋白,真核Rrp44/Dis3和细菌RNase R,具有进化上的策略相似性,诠释了“蛋白不同,策略相似”的进化原则。结论:首次证实mpy-RNase J具有duplex RNA解链活性;阐明了其基于空间位阻上的水解-解链相偶联的解链机制;揭示了甲烷古菌通过mpy-RNase J独自降解线性RNA或结构化RNA的方式来更优化地利用RNA,从而在RNA代谢中的具有核心调控作用。