背景与目的肺癌是严重威胁人类健康的恶性疾病之一，其发病率及死亡率均居恶性肿瘤之首。据统计，世界上每年约有135万肺癌新发病例，且有118万人死于该恶性疾病。尽管手术、化学治疗(化疗)、放射治疗(放疗)以及综合治疗手段在肺癌治疗中有了长足的发展，但肺癌总的5年生存率仍然很低，如美国只有15％，欧洲平均为10％，中国及其他发展中国家更低，仅为8.9％。在各类肺癌中，小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)是一种较为特殊的类型，它发展快、侵袭性强、易发生早期远隔转移，恶性程度最高，预后极差。SCLC虽然对化疗敏感，但很快即可产生多药耐药性；此外，由于化疗药物的毒副作用而被迫停药导致化疗失败。2003年美国临床肿瘤学会会议主席Dr.Bunn提出几乎所有肿瘤均需多学科综合治疗。1985年热疗被美国食品与药品管理局认证是继手术、放疗、化疗和生物疗法后的第5种肿瘤治疗方法，已在肿瘤的综合治疗中发挥了重要作用。在热化疗联合治疗的实验研究中，疗效会因为药物的种类、加热温度和时间的不同而有明显差异；紫杉醇系植物类抗癌药，属细胞毒类化合物，它可促使微管蛋白二聚体装配成微管并阻止其解聚，从而抑制了肿瘤细胞的有丝分裂，造成细胞死亡。临床应用发现紫杉醇治疗实体瘤有较好的效果，与其它抗肿瘤药物联合应用对肺癌有较好的治疗效果。加热能够诱导细胞周期阻滞，增加化疗药物的细胞毒效应，同时增强细胞凋亡的诱导效应，可能是热化疗联合的机制之一。加热联合紫杉醇治疗肿瘤业已获得较好的临床效果。截至目前，对加热与紫杉醇联合作用机制的研究还处于初级阶段。在联合作用上，尚需优化加热温度、时间及其与紫杉醇浓度的搭配。本研究以人小细胞肺癌细胞株NCI-H446细胞作为研究对象，采用细胞与分子生物学技术相结合的手段，研究加热与紫杉醇联合对人小细胞肺癌增殖抑制率的影响及其可能的作用机制，以寻找热化疗联合作用的最佳组合条件，为肺癌的综合治疗提供依据。材料与方法1材料人小细胞肺癌细胞株NCI-H446细胞由中科院上海生命科学院营养所馈赠，紫杉醇太极集团四川太极制药有限公司生产(国药准字H19994040)。2方法2．1实验分组2．1．1 MTT法检测NCI-H446细胞的增殖抑制率分组单纯加热组(39℃、40℃、41℃、42℃、43℃和44℃)；单纯紫杉醇化疗组(30μg／L、60μg／L、120μg／L、240μg／L和480μg／L)；加热联合紫杉醇组(单纯加热组和单纯紫杉醇组采用温度、浓度组合的方法进行热化疗联合)，每个处理组又分为3个加热时间段(30min、60min和90min)；对照组(0μg／L、37℃)。2．1．2半定量RT-PCR检测NCI-H446细胞中MMP-2和TNF-a表达量分组单纯加热组(43℃、90min)；单纯紫杉醇化疗组(60μg／L、120μg／L和240μg／L)；43℃加热90min联合紫杉醇组(60μg／L、120μg／L和240μg／L)；对照组(0μg／L、37℃)。2．2检测方法和指标在预实验的基础上，运用MTT法检测加热和紫杉醇单独或联合作用NCI-H446细胞后72h的增殖抑制率；以β-actin基因为内参照，运用半定量RT-PCR检测单纯43℃加热90min、单纯紫杉醇化疗(60μg／L、120μg／L和240μg／L)以及43℃加热90min联合紫杉醇(60μg／L、120μg／L和240μg／L)处理NCI-H446细胞后72h的MMP-2和TNF-a的表达量。2．3统计学分析应用SPSS13.0统计软件，采用析因设计ANOVA、单因素ANOVA和SNK多重比较结果对数据进行统计分析；检验水准a=0.05。结果1不同浓度紫杉醇对NCI-H446细胞增殖抑制率整体组间比较，差异均有统计学意义(F=338.798，P=0.000)，结合多重比较结果，不同浓度紫杉醇组与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，30μg／L与其它组间比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，60μg／L与其它组间比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而120μg／L、240μg／L和480μg／L 3组组间两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。由此得出紫杉醇在30μg／L～120μg／L对细胞增殖抑制作用随浓度的增高而增强，呈剂量-效应关系，差异均有统计学意义(P＜0.05)；但120μg／L以后化疗药对细胞增殖抑制呈水平状态，差异均无统计学意义(P＞0.05)，提示紫杉醇达到一定浓度时增加浓度并不能增强抑制率，再结合增殖抑制率评价标准(IR)，紫杉醇浓度为30μg／L，表现为不敏感；60μg／L，为低度敏感；120μg／L～480μg／L，为中度敏感，总体结果说明紫杉醇对NCI-H446细胞增殖抑制作用的最佳浓度是120μg／L，中度敏感。2不同加热温度对NCI-H446细胞的增殖抑制率整体组间比较，差异均有统计学意义(F=12.670，P=0.000)；结合多重比较结果，39℃、40℃和42℃与对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；41℃、43℃和44℃组与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)；39℃与41℃、44℃组间比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，而39℃与43℃组间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；43℃其它各组间比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，提示加热对H446细胞增殖抑制作用的最佳温度是43℃。3不同加热时间对NCI-H446细胞的增殖抑制率整体组间比较，差异均有统计学意义(F=242.569，P=0.000)，结合多重比较结果，30 min、60 min、90 min组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；在研究所选时间范围内，90min最优。在加热温度和时间比较的基础上结合基本统计量和IR评价标准，39℃～42℃各温度在不同加热时间下，以及43℃～44℃下加热30 min和60 min下，都表现为不敏感；43℃和44℃在加热90 min，表现为中度敏感，二者之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，选择43℃加热90 min。4由析因设计ANOVA结果可知加热温度、加热时间和紫杉醇三者对NCI-H446细胞增殖抑制率的影响，在所有组合中他们的交互效应表现为，紫杉醇与加热温度以及紫杉醇与加热时间之间无交互作用(P＞0.05)；而加热温度和加热时间之间有交互作用(P＜0.05)；三者之间有交互作用(P＜0.05)；结合基本统计量和IR评价标准，加热不同程度的提高了紫杉醇对NCI-H446细胞的增殖抑制率，敏感性提高了一个标准。对表现高度敏感的进行统计分析，由析因设计原理，理论上紫杉醇浓度、加热温度和加热时间三者的最佳组合条件是最大均值(0.917)的组合，即480μg／L联合43℃加热90 min，但在相同温度和相同时间作用下120μg／L和480μg／L组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，从临床考虑选择43℃加热90 min联合120μg／L(均值为0.909)定为最优组合条件。5运用单因素ANOVA及多重比较的方法，对经过不同处理的NCI-H446细胞中MMP-2表达量进行分析，得出紫杉醇化疗组和对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；单纯加热组以及加热联合紫杉醇组和对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)；单纯紫杉醇化疗组与之对应的加热联合紫杉醇组组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；加热联合紫杉醇组组间比较，除120μg／L联合加热和240μg／L联合加热(P＞0.05)比较，差异无统计学意义外，其余之间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。说明43℃加热90min联合120μg／L对NCI-H446细胞中MMP-2的表达量影响最大，提示热疗可能是通过降低MMP-2的表达量而抑制细胞增殖。6运用单因素方差分析及多重比较的方法，对经过不同处理的NCI-H446细胞中TNF-a表达量进行分析，得出60μg／L与对照组比较，差异无统计学意义(P=0.238)外，其余都有统计学意义(P＜0.05)；60μg／L与120μg／L比较，差异无统计学意义(P＞0.05)外，其余都有统计学意义(P＜0.05)；单纯紫杉醇化疗组与之对应的加热联合紫杉醇组组间比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)；120μg／L联合43℃加热90min和240μg／L联合43℃加热90min比较差异无统计学意义(P=0.058)外；其余组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；说明43℃加热90min联合120μg／L对NCI-H446细胞中TNF-a的表达量影响最大，提示热化疗还可能通过提高TNF-a表达量，增强免疫力的基础上抑制肿瘤细胞的增殖。结论1加热联合紫杉醇对NCI-H446细胞增殖抑制作用的最佳条件是，43℃加热90min联合紫杉醇120μg／L；2加热增强了紫杉醇对NCI-H446细胞的毒性作用，主要在于降低MMP-2的表达从而抑制肿瘤的侵袭和转移，同时提高了TNF-a表达量，杀死肿瘤细胞同时增强了机体的免疫力而抑制肿瘤细胞的增殖。