研究背景及目的随着科学技术的飞速发展,先进技术在医学领域起到越来越重要的作用,检验医学出现了两大主要发展趋势,一方面是各类大型自动化、高效率仪器设备的相继问世,大大提高了临床实验室的工作效率;另一方面是简易并且能及时提供准确结果报告的小型化仪器,越来越受到临床医护人员、病人及其家属的青睐,即时诊断,POCT(Point ofCare Testing)自1995年3月美国实验室标准化委员会(NCCLS,2005年更名为CLSI)在AST2-P(1999年被AST2-A取代)文件中首次提出后已成为检验医学的另一蓬勃发展方向。一方面随着社会的发展和经济的进步,快节奏已成为现代人工作、生活的主流方式,POCT适应了人们对时间的要求,满足医疗特别是危重病抢救时间上的需求,使患者尽早得到诊断和治疗;另一方面,由于人口整体素质的提高,健康理念的增强,人们对自身的健康状况和疾病进展状况非常关注,希望能够即时即地得到自己想要的健康信息。POCT因携带方便、操作方便、结果及时可靠,即能满足人们对自身健康状况的了解,也能满足医生快速准确获取患者诊断治疗信息的需求。因此POCT成为现代检验医学的重要发展方向。免疫层析技术、干化学技术、生物传感器、生物芯片以及红外和远红外分光光度技术等拥有各自优势的不同技术平台在POCT当中的不断拓展,产生了第一代的定性检测产品(试条试纸);第二代的半定量产品(色板卡比色或半定量仪器阅读);第三代的全定量系统产品(手工操作)以及第四代技术平台产品(自动化、信息化和智能化)。这一系列的产品群使得POCT的使用更为便捷,检测和应用的范围更加广泛,从最初的检测血糖、妊娠,扩展到监测血凝状态、心肌损伤、酸碱平衡、感染性疾病和治疗药物浓度监测(TMD)等;使用的场所,从事故现场、家庭,延伸到了病房、门诊、急诊、监护室、手术室甚至海关、社区保健站、私人诊所;应用的领域也已经从临床扩展到食品卫生、环境检测、禁毒、法医。而这其中,不需进行结合标记物与自由标记物的分离因而操作简单、快速,非常适合现场检测之用的免疫层析技术展现出了巨大的技术优势。免疫层析技术(immunochromatography assay,ICA)是上世纪八十年代初发展起来的一种简易、快速检测分析技术。它结合了标记示踪技术的高度灵敏性、抗原抗体反应的高度特异性以及层析技术的简易快速性,省去了繁琐的加样、洗涤步骤,因而操作简单,短时间(30min内)便可得到检测结果。按其原理主要分为两类,一类使用有色标记物如乳胶颗粒、胶体硒、胶体金以及脂质体等,层析时,标记物与待测物的络合物被富集在一定的检测区域内而浓集显色,以纤维膜上显色条的有无或多少主要进行定性或半定量分析;另一类则使用荧光标记物如普通荧光素、放射性同位素以及稀土元素,以荧光强度进行定量分析。2010年9月以来,发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)在中国湖北、河南、山东、江苏、安徽和辽宁等6个省份导致36名患者死亡,病例主要分布在山区和丘陵地带的农村,呈高度散发。且人群普遍易感,在丘陵、山地、森林等地区生活、生产的居民和劳动者以及赴该类地区户外活动的旅游者感染风险较高。这种疾病最初的病死率为30%,目前仍保持在10%左右的较高水平。卫生部紧急制定了《发热伴血小板减少综合征防治指南》(2010版),明确了 SFTSV感染的实验室诊断方法:主要通过病毒核酸实时定量PCR检测、病毒分离检测或者采用ELISA、IFAT、中和试验等方法进行血清特异性IgG抗体的检测。这些检测为SFTSV的及时诊断和治疗提供了一个非常有效的手段。然而,这种疾病经常发生在医疗条件差的山区,这些方法所需的专业技术人员和必要的实验室设备有限。再加上这几种检测方法过程繁琐,周期较长,无法满足传染病疾病早期诊断的需求。因此SFTSV快速检测试剂的研制是需求非常迫切的项目。基于SFTSV的传染性特征、需求的场所以及达到判断有无定性结果的目标,无需仪器、操作简单、易于携带、能快速准确获得检测结果的胶体金免疫层析检测试剂满足了市场的需求。本试剂的研制获得了国家863科技重大专项课题《传染病免疫诊断试剂的研制》的大力支持。随着侵损性诊断操作、细菌耐药性、严重烧创伤发生率、器官移植患者和放化疗患者的增加,医院性感染、败血症、脓毒症、脓毒性休克和多器官功能衰竭综合征(MODS)的发生率不断升高。感染性休克是目前ICU患者中的常见病症,其病死率很高。对于刚做完手术重症监护室病房的病人、新生婴儿来说因为手术感染导致的败血症,脓毒症等存在着较大的风险。败血症,急性器官功能障碍(重度败血症)是在非冠状动脉加护病房的头号死因。脓毒症是重症监护室最常见的严重疾病之一,是引起全身炎性反应综合征、MODS的常见原因,也是致残、致死率非常高的疾病之一。脓毒症休克也是一种常见的临床危重症,是ICU病房内患者主要死亡原因。因此对这些感染并发症进行早期诊断显得尤为重要。而有效治疗的关键在于快速而准确的进行病原学诊断。降钙素原(procalcitonin,PCT)是一种无激素活性的降钙素(calcitonin,CT)前肽物质,当细菌感染时会升高,在其他的炎性反应中如病毒感染、自身免疫性疾病和创伤等均不会升高,所以其具有良好的特异性及灵敏度。严重全身性细菌、真菌和寄生虫感染时,PCT异位生成,水平异常升高。且升高的程度与感染严重度及预后相关。同时,PCT还能及时反映抗生素是否有效,指导抗生素治疗,减少抗生素的使用,降低患者的治疗成本,避免细菌耐药性的产生。在全身性细菌感染、脓毒症辅助和鉴别诊断、预后判断、疗效观察以及指导抗生素用药方面有很高的临床价值。目前,市场上检测PCT的试剂盒也有多种,如基于化学发光法的PCT检测试剂、基于胶体金的PCT半定量检测试剂等,前者能准确定量,但是大型的检测用设备限制了 PCT检测项目深入社区等基层医疗单位,无法第一时间进行PCT指标的监控,容易贻误病情;后者快速简便,能在现场使用,但是存在定量不准的缺陷。因此开发一种即快速简便又能准确定量的检测试剂成为了当前主要的方向。时间分辨荧光免疫层析技术凭借着Stokes位移大,能很好的避免激发光谱和发射光谱部分重叠而的引起互相干扰,荧光衰变时间长,通过时间差实现高信噪比的优势,以及结合了免疫层析技术的优势,它在PCT快速定量检测试剂的开发有着更高的临床应用价值。方法:(一)发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂的研制1.发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原及链霉亲和素最佳标记pH以及最适标记量的摸索:在标记抗体过量的前提下,保证胶体金的聚集沉淀不是因为抗体量的原因而引起,仅仅是因为pH值的变化引起胶体金聚集,在此前提下,确定发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原及链霉亲和素的最佳标记pH条件;在最佳标记pH条件的条件下,以维持胶体金稳定的最低抗体量加10%的量为发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原及链霉亲和素的最适标记量。2.包被抗体的筛选:不同抗体在相同条件下包被,进行筛选评估,选择阴阳性符合率高的组合作为包被抗体使用原料。3.金标链霉亲和素的稀释度及质控线生物素-BSA偶联物包被量的确定:采用棋盘滴定法对金标链霉亲和素的稀释度及质控线生物素-BSA偶联物包被量进行确定。选择显色效果好、颜色清晰的条件为金标链霉亲和素的稀释度及质控线生物素-BSA偶联物包被量。4.金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原最佳稀释度与检测线M线包被量的确定:采用棋盘滴定法对金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原最佳稀释度与检测线M线包被量进行确定。选择阴阳性符合率最高的条件为金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原最佳稀释度与检测线M线包被量。5.检测线G单抗A37420最佳包被量的选择:根据已确定的条件的基础下,在G线上将A37420用10mM pH7.8 PBS包被缓冲液稀释成3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml共3个浓度梯度。选择阴阳性符合率最高的条件为检测线G单抗A37420最佳包被量。6.反应缓冲液的选择:缓冲液有助于层析,维持反应内环境稳定,屏蔽非特异性结合。我们通过配制不同反应缓冲液,同时检测阴性样本和阳性样本各10份,选择阴阳性符合率最高的作为最终的反应缓冲液。7.上样体积的确定:使用不同体积的反应缓冲液上样,通过层析现象的好坏来决定最佳的上样体积。8.样本最适稀释度的确定:通过一个梯度实验(1:100、1:200、1:400)来选择最适稀释度。9.试剂性能指标的评估:9.1最低检出限评估:使用发热伴血小板减少综合征病毒IgM抗体阳性血清样本以及发热伴血小板减少综合征病毒IgG抗体阳性血清样本倍比稀释的样本对试剂的最低检出限进行评估,以能检测出阳性的最低检出值作为试剂的最低检出限。9.2重复性评估:从同批试剂中随机抽样5人份试剂使用精密性参考品进行测定,通过反应结果是否一致,紫红色条带显色度是否均一来评估分析内重复性。在连续三批次试剂中随机取样5人份试剂使用精密性参考品进行测定,通过反应结果是否一致,紫红色条带显色度是否均一来评估分析间重复性。9.3特异性评估:收集发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgM/IgG检测阴性的流感病毒抗体阳性血清、汉坦病毒感染阳性血清、乙型肝炎病毒表面抗原阳性血清、丙型肝炎病毒抗体阳性血清、HIV阳性血清、抗核抗体及类风湿因子阳性血清,用本试剂对这些样本进行检测,看是否会有假阳性情况产生,从而对本试剂交叉反应现象进行研究。9.4抗干扰性评估:对加入了胆固醇、胆红素和甘油三酯的SFTSV-IgM和SFTSV-IgG弱阳性的血清进行测定,判断干扰情况,胆固醇、胆红素和甘油三酯的检测浓度逐渐升高,直至对检测结果或者检测过程照成影响为止。9.5稳定性评估:检测试剂在37℃条件下保存而不影响其性能的最长时间。10.临床考核试验:采用盲法对照的临床试验设计,以“金标准”方法中发热伴血小板减少综合征实验室确证方法作为对比方法:使用SFDA已批准的SFTS实时定量PCR核酸检测试剂“从患者标本中检测到发热伴血小板综合征病毒核酸”和/或IFAT检测“恢复期血清特异性IgG抗体滴度比急性期有4倍以上增高”为最终依据判定该样本感染发热伴血小板减少综合征病毒,作为该样本中是否存在SFTSV IgM抗体的对比方法;免疫荧光试验(IFAT)的检测结果判定该样本中是否存在IgG抗体作为检测IgG抗体的对比方法,使用统计软件SPSS 13.0,对数据进行分析。(二)降钙素原(PCT)时间分辨荧光免疫层析定量检测试剂的研制1.Eu标记抗体的收集与浓度测定:经BCA法测定各Eu标记抗体的浓度值。2.硝酸纤维素膜的选择:对Millipore公司的HF 125、HF 150和MDI公司的70CNPH-N-SS40作为备选膜,通过一系列实验对其性能进行研究,综合考虑阳性荧光值、阴性本底以及检测线与质控线的均匀性效果,确定最终的硝酸纤维素膜。3.时间分辨免疫荧光法筛选原料:将购买到的原料进行组合配对,进行TRFIA法筛选,综合剂量-反应曲线相关系数(r),同时辅以时间分辨免疫荧光法方法学的评判标准确定最佳原料组合。4.划线量的确定:将各个包被抗体分别用包被液稀释至相同浓度后,以不同包被量包被于NC膜上,将干燥后的时间分辨荧光微球标记抗体结合垫,NC膜以及其它辅料进行组装并切条,通过下一步的性能检测选择效果最佳包被量。5.标记抗体使用量的选择:将微球标记抗体用稀释液分别稀释为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml三个浓度梯度,喷量均为0.1μl/mm,与浓度为4.2mg/ml的16B5,以0.07 μ 1/mm的划线量包被的硝酸纤维素膜组装成试剂条,对标准品进行检测,综合考虑本底信号以及荧光值效果,选择最佳抗体使用量。6.试剂性能指标的评价6.1绘制剂量-反应曲线的绘制:以自配的参考标准品浓度的对数为自变量(X),以信号值的对数为因变量(Y),用双对数数学模型Log-Log函数处理,绘制剂量-反应曲线。6.2分析灵敏度:重复测量零定标品(A)20次,计算其均值及标准差。以其测定值的均值加上2倍标准差所得信号值代入剂量-反应曲线求出PCT的浓度值,为该试剂盒的最低检出量,即分析灵敏度。6.3准确度实验:取高值PCT血样一份,德国Roche Diagnstics Gmbu公司生产的降钙素原检测试剂盒(电化学发光法)测得其浓度为62.8ng/ml,用PCT阴性血清对其进行倍比稀释作为样品,在自制试剂盒上测定,计算其理论值及实测值的比值。6.4精密度实验:测定低、中、高3个质控品(质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),分析内精密度实验设5个试剂条,分析间精密度实验设同一批次试剂,3个不同人独立操作,得到各质控品检测值的均数、标准差及变异系数(CV)。6.5特异性实验:将CRP、IL-6、人降钙素、人抗钙素以定标品稀释液分别稀释至50ng/mL、1IU/mL、60ng/mL及30ng/mL作为样本,用配套仪器测定,结果应均小于0.08ng/mL。结果:(一)发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂的研制1.发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原及链霉亲和素最佳标记pH以及最适标记量的确定:在标记抗体过量的前提下,保证胶体金的聚集沉淀不是因为抗体量的原因而引起,仅仅是因为pH值的变化引起胶体金聚集,在此前提下,确定发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原的最佳标记pH条件分别为1ml金中加入0.1M的K2CO3 20 μl,链霉亲和素的最适标记pH条件为1ml金中加入0.1M的K2CO35μl;在最佳标记pH条件的条件下,以维持胶体金稳定的最低抗体量加10%的量为发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原及链霉亲和素的最适标记量,均为 23.1μg/ml。2.包被抗体的筛选结果:A37130及A37420包被的组合制得的试剂在阴阳性符合率方面,较之于其它两个组合,均具有相对较好的性能,我们最终选择Biospacific公司的A37420、A37130及Sigma公司的链霉亲和素和广州优迪生物科技有限公司的生物素-BSA偶联物做为本试剂的使用原料。3.金标链霉亲和素的稀释度及质控线生物素-BSA偶联物包被量的确定:根据实验结果,金标间接质控链霉亲和素的稀释度OD535=10,质控线浓度为0.05mg/ml,划线量为0.1μl/mm时,显色效果好、颜色清晰,因此,金标间接质控链霉亲和素的最佳稀释度OD535=10;质控线最佳浓度为0.05mg/ml,划线量为0.1μl/mm。4.金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原最佳稀释度与检测线M线包被量的确定:根据实验结果,金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原的稀释度OD535为45,喷量为0.8μl/mm,检测线M线浓度为2mg/ml,划线量为0.1μl/mm时阴阳性符合率最高,因此金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原的最佳稀释度OD535为45,喷量为0.8μl/mm;检测线M线最佳浓度为2mg/ml,划线量为0.1μl/mm。5.检测线G单抗A37420最佳包被量的选择:根据实验结果,检测线G线浓度为2mg/ml,划线量为0.1μl/mm时,阴阳性符合率最高,因此检测线G线最佳浓度为2mg/ml,划线量为0.1μl/mm。。6.反应缓冲液的选择:实验表明,使用Buffer4时阴阳性符合率最高,因此选择Buffer4为本试剂最适的反应缓冲液。7.上样体积的确定:实验表明,上样体积为60μl时层析过程最好,因此,决定上样最适体积为60μ1。8.样本最适稀释度的确定:实验表明,样本的稀释度在1:100时实验结果最好,因此,样本的最适稀释度为1:100μl。9.试剂性能指标的评估:9.1最低检出限评估:最低检出限以试剂检测能显示阳性结果的最低检出值来表示,检测结果显示反应试剂对发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgM和IgG抗体的最低检出限分别为稀释度不高于1:128和1:512。9.2重复性评估:实验结果显示,分析内、分析间反应结果均一致,紫红色条带显色度均一,分析内、分析间重复性良好。9.3特异性评估:根据试验结果,试剂不与汉坦病毒感染、流感病毒抗体阳性血清、乙型肝炎病毒表面抗原阳性血清、丙型肝炎病毒抗体阳性血清、HIV阳性血清、抗核抗体阳性血清及类风湿因子阳性血清发生交叉反应,试剂特异性良好。9.4抗干扰性评估:根据试验可知,当血样中胆固醇的浓度低于230g/L时,其对样本的检测结果无影响;胆红素的浓度低于1700mg/L时,其对样本的检测结果无影响;甘油三酯的浓度低于290g/L时,其对样本的检测结果无影响。9.5稳定性评估:经热稳定性考核发现,本试剂在37℃条件下放置22天不会对试剂性能造成影响,稳定性好。10临床考核试验:共检测样本1082例,其中临床确诊为SFTS样本245例,流感样本112例,HFRS样本58例,普通感冒人群样本38例,普通人群589例,HIV、HBV、HCV、RF样本各10例。与对比方法检测结果相比,1062例次样本检测结果与对比方法检测结果一致,20例次样本检测结果与对比方法检测结果不符。经统计分析,与对比方法检测结果相比,待考核试剂的阳性符合率达96.7%,阴性符合率达98.6%,总符合率为98.2%,总约登指数达到0.953,Kappa值为0.948(P<0.001),其中IgM检测的阳性符合率达98.4%,阴性符合率达100%,总符合率为99.6%,约登指数达到0.984,Kappa值为0.989(P<0.001);发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgG检测的阳性符合率达97.7%,阴性符合率达98.7%,总符合率为98.5%,约登指数达到0.964,Kappa值为0.945(P<0.001)。本次临床研究结果表明待考核试剂可靠、准确、安全、简便、稳定,具有较高的临床应用价值。(二)降钙素原(PCT)时间分辨荧光免疫层析定量检测试剂的研制1.Eu标记抗体的收集与浓度测定:各个抗体经Eu标记后纯化,均收集到2.5ml左右的洗脱液,经BCA法测定,各Eu标记抗体的浓度值均在90-11 0μg/ml。2.硝酸纤维素膜的确定:综合考虑阳性荧光值、阴性本底以及检测线与质控线的均匀性效果,最终选择MDI公司的70CNPH-N-SS40。3.时间分辨免疫荧光法筛选原料:综合剂量-反应曲线相关系数(r)的结果以及时间分辨免疫荧光法方法学的评判标准,最终选择MJG03作为标记原料,16B5作为包被原料。4.划线量的确定:综合考虑阳性荧光值、膜条本底以及检测线与质控线的均匀性效果,最终确定检测线的划线量为0.08μl/mm。5.标记抗体使用量的选择:综合考虑本底信号以及荧光值效果,最终选择标记抗体使用量为0.1mg/ml。6.试剂性能指标的评价6.1剂量-反应曲线的绘制:由双对数数学模型Log-Log函数处理,线性回归方程为Y=0.872X+3.088,计算剂量-反应曲线线性相关系数,r=0.9994。6.2分析灵敏度:重复测量零定标品(A)20次,计算其均值及标准差。以其测定值的均值加上2倍标准差所得信号值代入剂量-反应曲线求出PCT的浓度值,获得该试剂盒的最低检出量0.08ng/ml,即分析灵敏度0.08ng/ml。6.3准确度实验:取高值PCT血样一份,德国Roche Diagnstics Gmbu公司生产的降钙素原检测试剂盒(电化学发光法)测得其浓度为62.8ng/ml,用PCT阴性血清对其进行倍比稀释作为样品,在自制试剂盒上测定,计算其理论值及实测值的比值。各设3个平行实验,计算回收率。实测浓度与期望浓度测值的比值在0.90-1.13之间,回收率在90%-113%之间。6.4精密度实验:测定低、中、高3个质控品(质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),分析内精密度实验设5个试剂条,分析间精密度实验设同一批次试剂,3个不同人独立操作,得到各质控品检测值的均数、标准差及变异系数(CV),结果分析内变异系数为5.4%-7.7%,分析间变异系数为5.7%-13.4%。6.5特异性实验:将CRP、IL-6、人降钙素、人抗钙素以定标品稀释液分别稀释至50ng/mL、1IU/mL、60ng/mL及30ng/mL作为样本,用配套仪器测定,结果均小于0.08ng/mL。结果表明本试剂盒与CRP、IL-6、人降钙素和人抗钙素无交叉反应。结论:上述结果表明本研究研制的发热伴血小板减少综合征病毒胶体金免疫层析检测试剂及降钙素原(PCT)时间分辨免疫层析检测试剂的研制的各项指标(准确度、灵敏度、精密度、特异性等)均满足体外诊断试剂的注册要求,有望经进一步优化后应用于生产。