一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种气体自由基，广泛存在于各组织器官的各种细胞中，是重要的信使物质。它在循环系统、神经系统、消化系统、呼吸系统和免疫系统等多种病理生理过程中发挥重要的调节作用，在动物(包括人类)的饮食营养中受到重视。在生殖系统中，NO参与性行为的表现、类固醇激素的生成、精子发生、卵泡的发育和闭锁、卵母细胞的减数分裂成熟、受精、囊胚植入和胚胎发育等一系列生殖过程。NO对卵母细胞减数分裂成熟的研究主要集中于小鼠，在其他动物上报道不多，尤其是大家畜上研究较少，而且一些研究结果不一致。本论文以猪为对象，研究了NO在卵母细胞减数分裂中的作用及机理。 实验一研究了NO对猪卵母细胞成熟的影响，包括卵丘细胞包被的卵母细胞(cumulus-enclosed oocytes, CEOs)和脱除卵丘的卵母细胞(denuded oocytes, DOs)。用不同浓度的NO供体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)(0mM、0.1 mM、1 mM和10mM)处理CEOs和DOs，培养结束后，检测卵丘细胞扩展、DNA片段化和卵母细胞减数分裂成熟情况。结果发现，SNP可剂量依赖性地抑制卵丘细胞的扩展和DNA片段化，同时抑制CEOs中卵母细胞的减数分裂恢复，抑制MⅠ向MⅡ期转变。SNP对DOs减数分裂恢复基本没有影响。结果表明，高浓度的NO能通过调节卵丘细胞的功能活动抑制猪卵母细胞的减数分裂恢复，尤其是抑制MⅠ期到MⅡ期的发育过渡。 实验二研究了NO对卵母细胞减数分裂成熟的作用与其培养环境的关系。将CEOs培养于SNP、促性腺激素(FSH和hCG)或/和β-巯基乙醇(β-ME)环境中。结果发现，在自发成熟模型中，SNP能促进卵丘扩展，该作用能被β-ME逆转；SNP不影响CEOs的减数分裂恢复，但可抑制其发育到MⅡ；在生理成熟模型(次黄嘌吟培养基)中，SNP和β-ME都不影响卵丘扩展，但抑制促性腺激素诱导的卵丘扩展。SNP还抑制促性腺激素诱导的减数分裂恢复，尤其是抑制CEOs发育到MⅡ期，而β-ME能逆转SNP的这种作用。在两种培养模型中，β-ME均可促进促性腺激素诱导的减数分裂恢复，促进CEOs发育到MⅡ。实验结果还发现，HX能增加猪卵母细胞透明带的脆性，而促性腺激素、SNP或β-ME均可减弱这种作用。本实验表明，NO在不同的猪卵母细胞成熟模型中作用也不相同，这种作用受自由基清除剂β-ME的影响。 实验三研究了维生素C和E(Vc，Ve)在卵母细胞减数分裂成熟过程中的抗自由基作用。将CEOs和DOs分别培养于不同浓度的Ve(0μM，10μM，100μM和200μM)和Vc(0μM，50μM，250μM和750μM)中，发现两者都不影响卵丘细胞的扩展，但都能抑制卵丘细胞的凋亡；α-生育酚或L-抗坏血酸可促进DOs恢复减数分裂，并进一步促进DOs发育到MⅡ期，但两种维生素都不影响CEOs减数分裂成熟。这些结果表明维生素C和E促进DOs恢复减数分裂和发育到MⅡ期，可以抑制卵丘细胞的凋亡，尤其是10μM的生育酚和250μM的抗坏血酸。 实验四研究了参与卵母细胞减数分裂成熟的NOS的类型。用不同的NOS抑制剂处理猪CEOs和DOs，即iNOS选择性抑制剂氨基胍(aminoguanidine, AG)和eNOS及iNOS的非选择性抑制剂左旋硝基精氨酸(Nco-nitro-L-arginine, L-NNA)和左旋硝基精氨酸甲基酯(Nto-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)。发现AG能抑制卵丘扩展和CEOs的减数分裂恢复，但对卵丘细胞DNA的片段化没有显著影响。L-NAME或L-NNA则同时抑制卵丘扩展，卵丘细胞DNA片段化和CEOs减数分裂成熟，但对DOs的作用不显著。结果表明，iNOS产生的NO对于卵丘扩展和卵母细胞减数分裂成熟是必需的，eNOS和iNOS产生的NO均参与了卵母细胞减数分裂成熟，这些作用可能是通过介导卵丘细胞的功能活动实现的。 实验五研究了不同类型NOS在不同发育阶段的卵泡(包括卵母细胞)中的免疫组织化学定位。实验五分三个部分，第一部分是培养腔前卵泡(250一300林m)，在培养基中分别加入0 mM (对照组)，0.1 mM，0.3，nM，0.5 mM不1.1，nM sNP，培养4d后观察卵泡的成腔情况。结果发现，0.1 mM SNP对成腔率没有显著影响(P>0.05)，而0.3 mM，0.5 mM或l一nM SNP则可显著抑制成腔率(尸<0.05)。第二是培养CEOs时分别加入0.1 mM SNP和NOS抑制氨基肌(aminoguanidine biearbonate salt，AG，1 0 mM)不11左旋硝基精氨酸甲基酷(N。一nitro一L一a唱ininemethy!ester，L一NAME，1 mM)，培养44h后观察卵母细胞减数分裂成熟情祝。结果发现，^G显著抑制卵母细胞的减数分裂恢复，而L一NAME则可抑制第一极体(first Polar body，PBI)的排出。第三，利用免疫组织化学的方法研究两种NOS在卵巢上小(直径1~Zm!n)、中(3一6 mm)、大(7一lomm)卵泡包裹的卵母细胞、卵泡以及黄体(eo甲usluteum，CL)不11一勺体(eo甲usalbiean，CA)中的特异性表达部位。结果发现，eNOS在腔前卵泡中有表达，但免疫阳性染色仅限于卵母细胞和膜细胞层，这种eNOS表达从小、中到人卵泡包裹的卵母细胞逐渐增强，并且大卵泡中的卵丘细胞也开始表达eNOS，而此前的卵丘细胞井不表达eNOS。在黄体的周围，部分粒性黄体细胞呈现eNOS免疫阳性染色，而在白体中，eNOS阳性染色见于部分实质内。在原始卵泡和早期有腔卵泡「}一