用水量大,耗能高,污染重,资源综合利用不足是目前发酵工业存在的普遍问题。而且随着发酵规模的扩大,这些问题将日益突出。为了彻底解决节能节水及实现废水的综合利用,本实验室近年来提出了发酵生态工程学理论,以生物质酒精工业为例建立了酒精-沼气双发酵耦联循环工艺。该循环工艺可显著缩短酒精发酵时间,但回用水的质量是影响酒精发酵效果的核心要素。研究发现回用水中含有的低浓度乙酸可促进酒精发酵,主要表现为提高单位菌体酒精产率、降低甘油产率。另外,在酒精-沼气双发酵耦联循环工艺运行过程中,以非偏好型氮源尿素为唯一氮源时,酿酒酵母的生长情况却优于以氨为唯一氮源,而且酒精发酵效果好(酒精产率高,主要副产物甘油产率低)。因此,本论文以低浓度乙酸以及非喜好氮源尿素可促进酒精发酵为研究对象,利用微生物生理学、RNA-测序(RNA-Seq)技术以及代谢组学技术,研究其可提高酒精发酵的机制。具体研究结果如下:1)混合水的发酵速率要比自来水高。自来水的葡萄糖酒精发酵一般在56 h结束,而混合水的发酵时间在32 h结束,与自来水相比,发酵时间缩短了 42.86%。当添加乙酸浓度分别为30 mM(1.8 g/L),60 mM(3.6 g/L)时,其发酵速度高于自来水,但当乙酸浓度为90 mM时,其发酵速度低于自来水。说明当乙酸浓度低于60 mM时,其对酒精发酵有促进作用,大于60 mM时促进作用减弱。以尿素为氮源的酿酒酵母酒精发酵在42 h内即可完成耗糖,而用硫酸铵作氮源时则需要56 h才能完成耗糖。而且,以尿素为氮源时的酒精产率高副产物甘油产率低。2)低浓度乙酸的存在虽然加大了酿酒酵母胞内外的pH差值,但并没有影响酵母胞内pH的变化。添加低浓度乙酸提高了酿酒酵母胞内ATP的含量,减少了需要氧化的NADH的量,因此减少了甘油的生成。与对照相比,当乙酸浓度为60 mM时,胞内海藻糖提高了 32.27%。而当乙酸浓度为90 mM时,胞内海藻糖浓度相比对照提高了51.72%。海藻糖的积累可能是为了保护细胞蛋白质和细胞膜免受酸化的影响。当乙酸浓度达到90 mM时,细胞开始破裂,并严重影响出芽。当乙酸浓度在60 mM时,酵母细胞虽然没有被破坏,但是细胞的出芽受到了影响,出芽率降低。但当乙酸浓度为30mM时,与对照相比,细胞形态没有显著差异。综上,低浓度乙酸不会引起酵母细胞膜的破坏,反而会刺激酿酒酵母提高单位菌体的酒精产量。3)以硫酸铵为氮源时,发酵过程中的pH低于同期以尿素为氮源时的pH,且在4.5 h以后发酵液pH一直维持在3.0以下。以铵为氮源的胞内ATP(0.36 mg/g DCW)远高于以尿素为氮源的胞内ATP(0.16 mg/g DCW)。同时,在对数生长中期,以尿素为氮源的胞内NADH(0.22 mg/g DCW)比以铵为氮源的胞内NADH(0.13 mg/g DCW)高69.23%。即过量的NADH会抑制ATP的合成。以尿素为氮源的酵母胞内pH为7.0,高于以硫酸铵为氮源的胞内pH 6.2,即以硫酸铵为氮源时酵母细胞出现了酸化现象。以尿素为氮源的3-磷酸甘油脱氢酶酶活较以铵为氮源的酶活低,这与以尿素为氮源产甘油较少的发酵结果一致。以硫酸铵为氮源增大了酵母细胞胞内外的膜电势,而细胞膜电势的增大意味着酵母死亡率的提高。4)以RNA-Seq技术考察酿酒酵母的全局基因转录水平变化。低浓度乙酸刺激条件下,三个时间点的共同显著性差异基因有31个,其中10个总体上调基因,20个总体下调基因。具有显著差异的氧化还原酶类上调基因占75%,而下调基因则主要是与糖酵解有关的氧化还原酶类基因。YDR210W-D,YPR158W-B,YDR261C-D三个基因在不同时间段上调,是酿酒酵母应对低浓度乙酸刺激的一种表现。REX4基因上调是酿酒酵母应对低浓度乙酸刺激的关键和前提因素。GRC3基因的上调意味着可以增强GRC3对RNA的结合能力。ENA1转录水平的下调使得酿酒酵母胞内外盐离子浓度发生了改变。5)与尿素相比,以硫酸铵为唯一氮源时,与细胞生长相关的基因如ERR1,ERR2,ERR3均上调。其中,ERR2p和ERR3p可以将2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇丙酮酸,因此,以硫酸铵为氮源强化了 2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯式丙酮酸的代谢途径。SSQ1基因编码的分子伴侣DnaK与细胞生长的环境有密切的关系。该基因的显著上调说明酵母的生长环境发生了很大的变化。SP020基因的上调可能是酵母细胞应对低pH生长环境的一种应激反应。SMP1基因可以编码一种Hog1依赖的转录因子,SMP1与Hog1相互作用,并且SMP1在渗透胁迫下以一种与Hog1相关的方式磷酸化。由此推测,该基因的上调与以硫酸铵作为氮源时甘油的产量提高有关。6)通过代谢组学分析可知,低浓度乙酸刺激导致大部分参与三羧酸循环的有机酸在对数生长期明显下降。除了柠檬酸含量有略微上升的趋势,其余有机酸均呈下降趋势,值得注意的是乙酰辅酶A的下降变化趋势。以上结果表明低浓度乙酸刺激使得三羧酸循环减弱。同时,甘油代谢途径、谷氨酸代谢途径均被弱化。尤其是三磷酸甘油的下调,是低浓度乙酸刺激引起甘油下降的直接原因。7)与尿素作为氮源相比,硫酸铵作氮源时导致大部分参与三羧酸循环的有机酸含量在对数生长期明显下降。除了琥珀酸含量有略微上升的趋势,其余的有机酸均呈下降趋势,以上结果表明以硫酸铵作为氮源使三羧酸循环减弱。硫酸铵为氮源时天冬氨酸和亮氨酸无明显变化,苏氨酸呈上升趋势,其余大部分氨基酸呈下降趋势。与硫酸铵作为氮源相比,以尿素为氮源弱化了甘油代谢途径。因此,以尿素为氮源进行酒精发酵时,副产物甘油较少。