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支气管哮喘是呼吸系统常见病和多发病,其发病机制至今尚不清楚。由于它的难治性,WHO把哮喘定为终身性疾病。哮喘的病理生理主要表现为气道的炎症反应、气道重塑和气道高反应性。哮喘气道重塑的特征是气道上皮的粘液细胞化生,基底膜纤维化,成纤维细胞和平滑肌细胞肥大和增生,这些都是导致哮喘气道高反应性和和死亡的主要原因。SHH是HH信号通路主要分泌型配体分子之一,其在肺发育过程中呈现高表达现象,并随着肺的发育成熟,表达逐渐降低。目前,在许多肺部疾病,如肺损伤、肺纤维化和哮喘中均发现了SHH异常高表达现象。在哮喘中,SHH异常高表达的诱导因子及其机制,以及SHH对哮喘疾病进展作用尚未有报道。目的:1.确认SHH在哮喘疾病中的表达模式2.探索SHH高表达的诱导因素及其机制3.探索SHH对哮喘疾病进展的作用及其机制方法:1.分别用OVA和HDM诱导小鼠建立哮喘模型,采用免疫荧光或免疫组化的方式检测SHH及下游关键信号分子PTCH1的表达水平及表达部位。2.采用Th2型炎症因子(IL-4、IL-13和IL-5)体外诱导人16HBE细胞系,探索SHH表达的诱导因子及对气道上皮细胞本身HH信号通路的作用。3.相应炎症因子肺部给予小鼠,探索其体内对SHH及其通路的诱导作用。4.OVA诱导的小鼠哮喘模型给予STAT6抑制剂,观察其在疾病模型下对SHH表达的作用,验证信号通路。5.OVA诱导C57小鼠哮喘模型,并雾化吸入SMO抑制剂环巴胺1和6 mg/m L,观察环巴胺对肺部炎症细胞浸润、杯状细胞化生和粘液蛋白Muc5ac表达的影响。6.OVA诱导SMOflox/flox小鼠,气道滴入Cre腺病毒构建气道上皮细胞敲除SMO的小鼠哮喘模型,观察肺部炎症细胞浸润、杯状细胞化生和粘液蛋白Muc5ac表达的变化。7.OVA诱导R26-SMO-M2小鼠,然后利用气道滴入Cre腺病毒构建气道上皮细胞过表达激活形式SMO的哮喘模型,观察肺部炎症细胞浸润、杯状细胞化生和粘液蛋白Muc5ac的表达。8.在16HBE细胞中采用SMO激动剂Purmorphamine与重组N-SHH刺激,观察SHH对粘液蛋白Muc5ac极其关键调控蛋白FOXA2和SPDEF表达的影响;分别利用sh Gli1和sh Gli2慢病毒敲除Gli1和Gli2,观察激活HH信号对粘液蛋白Muc5ac和关键信号分子表达的调控是否依赖转录因子Gli。9.OVA诱导小鼠哮喘模型,肺内滴入SHH中和抗体,观察中和SHH后对肺部炎症细胞浸润、杯状细胞化生和粘液蛋白Muc5ac表达的影响。结果:1.我们在OVA诱导小鼠哮喘模型肺组织中发现了SHH高表达现象,并进一步通过免疫组化染色发现SHH主要集中高表达在气道上皮细胞。在HDM诱导的小鼠哮喘模型中同样发现了SHH高表达于气道上皮细胞。同时,哮喘患者的BALF中SHH含量对比异物吸入组显著增高,免疫荧光染色显示SHH主要表达在以CC10为标记的克拉细胞上。2.IL-4和IL-13能剂量依赖的诱导16HBE细胞中SHH的转录和蛋白表达,并能诱导16HBE细胞的Gli1的表达和Gli转录因子荧光素酶活性上升,然而IL-5对上述的诱导作用均不显著。SHH中和抗体能显著的抑制IL-4诱导Gli1的表达和Gli转录因子荧光素酶的活性上升。进一步发现IL-4/IL-13下游信号分子JAK1/2和STAT6抑制剂能显著的抑制IL-4诱导的SHH表达,且过表达JAK1/2及其激活形式和STAT6均能显著的诱导SHH表达、Gli1的表达和Gli转录因子荧光素酶活性上升。CHIP实验发现STAT6能直接结合在SHH启动子区域来介导SHH转录。这些结果表明IL-4/IL-13主要通过JAK1/2-STAT6信号诱导SHH表达分泌,并且这些SHH可以激活16HBE的HH信号。3.IL-4和IL-13 400 ng/m L肺部滴入能显著诱导小鼠肺气道上皮细胞中SHH的表达和p-STAT6水平。4.STAT6抑制剂AS能显著抑制OVA造模诱导的气道上皮细胞中的SHH高表达现象。5.雾化吸入1和6 mg/m L的环巴胺能剂量依赖的抑制OVA诱导的小鼠哮喘模型肺部炎症、杯状细胞化生和Muc5ac的表达;且环巴胺1 mg/m L并不能抑制肺部炎症产生,但对杯状细胞化生和Muc5ac的表达仍有显著的抑制作用。6.气道上细胞中敲除SMO对OVA诱导的肺部炎症无显著作用,但对杯状细胞化生和Muc5ac的表达具有显著的抑制作用。7.气道上细胞中过表达激活形式SMO对OVA诱导低炎症状态下哮喘模型的肺部炎症无显著作用,但能显著诱导杯状细胞化生和Muc5ac的表达。8.Purmopharmrin、N-SHH以及过表达Gli2和△N-Gli2均能显著的诱导Muc5ac荧光素酶报告基因活性,而敲除Gli1或Gli2能显著抑制Purmopharmrin的诱导作用;同时CHIP实验证实Gli2能直接与Muc5ac启动子区域相结合。Purmopharmrin和N-SHH均能显著抑制FOXA2的蛋白水平,同时诱导SPDEF的表达;敲除Gli1或Gli2或SMO抑制剂环巴胺能显著抑制这种效应。9.SHH中和抗体能显著的抑制OVA诱导的小鼠哮喘模型的肺部炎症、杯状细胞化生和Muc5ac的表达。结论:1.在小鼠哮喘模型和哮喘患者中,气道上皮细胞中SHH呈现异常高表达现象。2.Th2炎症因子IL-4和IL-13是诱导这种SHH高表达的主要诱导因素,二者均通过JAK1/2-STAT6信号诱导气道上皮细胞中SHH的表达,且STAT6可以通过直接结合在SHH启动子区域的方式介导SHH的转录。3.气道上皮细胞中高表达的SHH可以激活自身的HH信号,从而促进哮喘的杯状细胞化生和粘液蛋白分泌。4.激活的HH信号可以通过Gli转录因子直接结合粘液蛋白Muc5ac的启动子区域调控粘液蛋白表达,也可通过上调SPDEF或下调FOXA2的方式调控粘液蛋白Muc5ac的表达。