高血压病是严重危害人类健康的常见心血管疾病之一,高血压可引起血管结构和功能的改变,即高血压血管重构,可促进高血压进展和心血管致残率和死亡率升高。目前,对于高血压血管重构的发病机制仍不明确,并且如何预防与逆转血管重构,已成为目前抗高血压治疗及预防高血压并发症的重要课题。血管重构被认为最早也是最广泛的高血压靶器官损害。动脉结构和功能的重构性变化既是高血压病血液动力学紊乱、神经体液变化和局部内分泌因素改变的适应性反应,又是高血压病发展恶化及心脑肾等其他靶器官损害的重要病理基础。因此,探讨高血压血管重构的发生机制以逆转血管重构是防治高血压及其靶器官损害的关键所在。血管壁细胞外基质(vascular extracellular matrix,ECM)是存在于组织细胞表面或细胞之间的一组蛋白大分子,主要包括胶原蛋白、非胶原糖蛋白和蛋白多糖,受多种细胞因子及酶调节,其组成处于动态变化之中。血管重构典型的特征包括ECM增多和成分的改变。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是降解ECM成分的最主要蛋白水解系统,金属蛋白酶组织抑制因子(Tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)是基质金属蛋白酶的内源性特异性抑制因子,通过与MMPs的催化区域结合,阻止MMPs与底物结合而调节MMPs活性。生理状态下,MMPs/TIMPs保持相对平衡,胶原蛋白结构、功能正常。动脉血管细胞外基质的变化是动脉血管重构的本质,细胞外基质的变化可以导致动脉弹力纤维降解及胶原成份的改变,使动脉壁结构及功能异常。Fibulins是一个细胞外基质蛋白家族,参与ECM结构的合成与稳定,其主要功能是形成和稳定基膜、弹性纤维和疏松结缔组织。自发现第一个Fibulin-1以来,已经分离出了7个成员,Fibulin-3和Fibulin-4,5同属于Fibulins蛋白家族中第二亚组成员,分子结构细小(50-60 kDa)和有着高度同源性,它们都含有特征性的串联排列的Ca2+结合表皮生长因子样结构域和C-末端fibulin结构域。研究发现,在Fibulins家族中,Fibulin-1与血管硬化存在相关性,Fibulin-4在弹性纤维的形成以及平滑肌细胞在动脉壁的终端分化和成熟起着双重作用,对主动脉损伤起着修复作用,Fibulin-5与动脉粥样硬化的发生以及血管氧化应激过程相关联。目前对于Fibulin-3的研究,主要集中在肿瘤和盆腔支持组织间质中细胞外基质结构的聚集和稳定过程,尚未见Fibulin-3在血管,特别是对大动脉细胞外基质结构方面的报道。已发现Fibulin-3与TIMP-3较强的相互作用,能刺激TIMP-1和TIMP-3的表达,抑制基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-3和MMP-9)的表达；在Fibulin-3水平下降或基因沉默情况下,随着Fibulin-3的降低,TIMP-3表达水平降低,对MMPs的抑制作用减弱,MMPs活性增强,导致MMPs/TIMPs失衡,引起肿瘤和盆腔支持组织间质中细胞外间质重构,导致肿瘤早期淋巴结转移和压力性尿失禁的发生。因为在血管中MMPs/TIMPs的水平变化影响ECM的稳定和血管结构和功能的变化,那么,Fibulin-3是否能够产生对MMPs/TIMPs的影响,继而影响动脉壁ECM的成份变化和纤维蛋白的含量和结构呢?目前,尚未见Fibulin-3在血管性疾病方面,特别是高血压血管重构的研究报道。为此,我们设想Fibulin-3对MMPs、TIMP-3、ECM的影响同样存在于高血压动脉基质中,并且对血管纤维的结构改变存在重要影响,与高血压病程的发展存在相关性。这对研究高血压血管重构的损伤和／或修复机制有着重大意义。第一章Fibulin-3在自发性高血压大鼠胸主动脉中的表达及与基质金属蛋白酶及其抑制因子的相关性目的：Fibulin-3作为细胞外基质蛋白,参与细胞外基质(vascular extracellular matrix,ECM)的合成与稳定,本研究主要探讨Fibulin-3及基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases, MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子-3 (Tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMP-3)在自发性高血压大鼠血管重构中的表达及相关性。方法；选择8周龄和16周龄的雄性自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)为实验组；同周龄健康Wistar京都(WKY)大鼠为对照组；所有大鼠均购买于北京维通利华公司,合格证书号：SCXK(沪2003-0003)。经腹腔注射3%戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉处死,解剖,取出胸主动脉作为研究对象。胸主动脉经苏木素-伊红(H-E)染色分析血管壁病理改变：包括主动脉血管壁厚度(中-内膜厚度)和血管壁厚度/管腔比值；运用免疫组织化学染色和Western blot蛋白电泳分析胸主动脉Fibulin-3、MMP-2、MMP-9、TIMP-3蛋白水平表达；采用Real-time PCR (RT-PCR)检测胸主动脉Fibulin-3、MMP-2、MMP-9的mRNA水平表达；运用Image-Pro Plus 6.0软件对免疫组化染色切片进行灰度定量检测。结果：在16周龄的SHR中,大鼠血压(收缩压,222±14.66mmHg)显著升高,显著高于其他3组[8周龄SHR大鼠(142±8.89 mmHg),8周龄WKY大鼠(118±14.3mmHg)和16周龄WKY大鼠(120±8.5mmHg)],差异有极显著统计学意义(P<0.001)；可见胸主动脉出现管壁增厚(97.80±5.39um),血管壁/腔比值增大,达(7.95±0.37)%,与其他3组比较,差异有极显著统计学意义(P<0.001),光镜下可见血管平滑肌细胞排列紊乱,细胞体积粗大,数量减少,出现血管重构；而8周龄SHR组和8周龄WKY大鼠组及16周龄WKY大鼠组血管壁病理改变并不显著。进一步通过免疫组化、western blot检测胸主动脉Fibulin-3、MMP-2、 MMP-9、TIMP-3蛋白的表达,显示16周龄的SHR胸主动脉Fibulin-3、MMP-2、 MMP-9蛋白表达显著高于8周龄SHR和WKY大鼠及16周龄WKY大鼠,而TIMP-3蛋白表达在4组间改变并不显著。同时16周龄SHR胸主动脉Fibulin-3、 MMP-2、MMP-9的mRNA水平表达显著高于8周龄SHR和WKY大鼠及16周龄WKY大鼠；因TIMP-3蛋白表达水平低,未进行mRNA水平水平检测。大鼠血管壁Fibulin-3蛋白表达水平与MMP-2、MMP-9表达水平之间进行相关性分析显示,Fibulin-3与MMP-2呈正相关(r=0.518, P=0.001);Fibulin-3与MMP-9呈正相关(r=0.674,P=0.000)。结论：16周龄的SHR出现高血压血管重构,Fibulin-3、MMP-2和MMP-9在高龄SHR主动脉壁中表达增加,Fibulin-3表达水平和MMP-2,9水平存在相关性,可能参与了高血压血管重构的病理过程。第二章Fibulin-3对高血压大鼠血压及主动脉重构的影响目的：探讨Fibulin-3和MMP-2,9、TIMP-3在自发性高血压大鼠中高血压血管重构的表达及高血压血管重构血管纤维组织(包括胶原纤维、弹力纤维和网状纤维)的病理改变和胸主动脉氧化应激水平的变化；同时通过尾静脉注射外源性Fibulin-3蛋白提高体内Fibulin-3水平,研究Fibulin-3对高血压大鼠血压、胸主动脉壁纤维组织和氧化应激水平及MMP-2,9、TIMP-3的影响。方法：30只8周龄雄性SHR大鼠随机分为3组：分别经尾静脉注射外源性Fibulin-3蛋白120mg/kg(低剂量组,FBLN1组,n=10)、240mg/kg(高剂量组,FBLN2组,,n=10)和生理盐水(安慰剂组,n=10),每周注射1次至16周龄；同周龄雄性的Wistar大鼠10只作为对照组；所有大鼠均购买于北京维通利华公司,合格证书号：SCXK(沪2003-0003)。所有大鼠喂养至16周龄,经腹腔注射3%戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉处死,解剖,取出胸主动脉作为研究对象。胸主动脉经苏木素-伊红(H-E)染色分析血管壁厚度和管壁/腔比值；Masson三色染色法检测血管壁胶原纤维的表达；醛品红法染色检测血管壁弹力纤维的表达：氢氧化银氨液浸染法检测网状纤维的表达；冰冻切片经二氢乙啶(Dihydroethidium, DHE)孵育后,绿光激发显示血管活性氧族物质(Reactive Oxygen Species, ROS)在细胞内的表达情况。免疫组织化学染色和Western blot蛋白电泳分析胸主动脉Fibulin-3、 MMP-2、MMP-9、TIMP-3蛋白水平表达；RT-PCR检测胸主动脉Fibulin-3、 MMP-2、MMP-9的mRNA水平表达；运用Image-Pro Plus 6.0软件对免疫组化染色切片进行灰度定量。结果：在所有SHR中,大鼠血压(安慰剂组224±15.0mmHg、FBLN1组207±14.5mmHg和FBLN2组180±13.7mmHg)显著高于对照组血压(121±10.0mmHg),差异有极显著统计学意义(P<0.01)；在FBLN1组和FBLN2组中,大鼠血压有所下降,以FBLN2组血压(180±13.7mmHg)下降显著,与安慰剂组(224±15mmHg)比较,差异有显著统计学意义(P<0.05)；与对照组比较,安慰剂组可见到显著血管重构改变,胸主动脉血管平滑肌细胞排列紊乱,出现管壁增厚(97.78±5.39um vs82.23±6.02um),血管壁/腔比值增大(7.91±0.6% vs 6.35±0.55%),差异均有显著统计学意义(P<0.05)；在FBLN1组和FBLN2组中可见胸主动脉血管管壁明显增厚(105.99±5.92um和121.7±10.81um),与安慰剂组比较,差异有显著统计学意义(P<0.05),FBLN2组与FBLN1组比较,差异有显著统计学意义(P<0.05)；但FBLN1组与FBLN2组血管壁/管腔比值(8.15±0.38%和7.96±0.41%),增大不明显,与安慰剂组(7.91±0.6%)比较,差异无统计学意义(P>0.05)；在对照组胸主动脉中,血管壁胶原纤维分布较为零散,中膜弹力纤维板排列整齐,中膜弹力纤维板完整、排列整齐、有序；而在安慰剂组中,可见到在胸主动脉中,胶原纤维成分显著增多,弹力纤维排列疏松、紊乱,甚至断裂,数量减少,肌纤维肥大增生显著；与安慰剂组比较,FBLN1组和FBLN2组胶原均有所减少,FBLN2组胶原数量与对照组相近,而弹力纤维数量较安慰剂组显著增多,比较完整,排列整齐,纤维束横径显著粗,FBLN2组的弹力纤维增粗最为显著；采用image plus软件对各组中弹力纤维横径进行测量,结果显示：安慰剂组(4.56±0.70um)、FBLN1组(5.03±0.86 um)和FBLN2组(7.61±0.89 um)均高于对照组(3.52±0.63 um)比较,差异有显著统计学意义(P<0.05); FBLN2组高于安慰剂组和FBLN1组,差异有极显著统计学意义(P<0.01)。在网状纤维染色中,中膜网状纤维呈黑色,附着于弹力纤维周围；在高血压大鼠中(安慰剂组、FBLN1组和FBLN2组)网状纤维较对照组显著增多,但三组间无显著差异。在血管氧化应激实验中,ROS阳性细胞在整个核区被染成红色,可以看到,正常大鼠主动脉壁阳性细胞少或无,安慰剂组血管环中可见较多阳性细胞胞核染成红色,说明血管氧化性高；FBLN1组和FBLN2组阳性细胞数较安慰剂组减少,以FBLN2组为显著,说明Fibulin-3治疗后显著抑制血管氧化水平。进一步通过免疫组化、western blot检测胸主动脉Fibulin-3、MMP-2、MMP-9、TIMP-3蛋白的表达,显示安慰剂组的SHR胸主动脉Fibulin-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著高于对照组；在注射Fibulin-3蛋白低剂量组(FBLN1组)和高剂量组(FBLN2组)中,Fibulin-3蛋白表达有所升高,以FBLN2组升高比较显著；而MMP-2、MMP-9蛋白表达在FBLN1组和FBLN2组有所减弱,以FBLN2组减弱比较显著。而TIMP-3蛋白表达在4组间改变并不显著,因TIMP-3蛋白表达低下,未进行mRNA水平检测。同时,通过RT-PCR检测大鼠胸主动脉Fibulin-3、MMP-2、MMP-9的mRNA表达水平,发现Fibulin-3、MMP-2、MMP-9的mRNA水平在安慰剂组高于对照组,在FBLN1组和FBLN2组中,Fibulin-3的mRNA水平有所升高,以FBLN2组升高比较显著,MMP-2、MMP-9的mRNA水平在FBLN1组和FBLN2组有所下降,以FBLN2组下降比较显著。结论：高血压血管重构时可出现血管壁增厚,血管壁／腔比值增加,胶原纤维成分明显增多,弹力纤维排列疏松、紊乱,甚至断裂,血管氧化水平增高；Fibulin-3及MMP-2、MMP-9参与高血压血管重构的发生过程；注射外源性Fibulin-3蛋白可以降低高血压大鼠的血压水平,改变胸主动脉血管重构的病理表现,抑制胶原纤维增生,对弹力纤维损伤起到修复作用,同时抑制血管氧化应激状态,抑制血管壁MMP-2、MMP-9表达水平。第三章Fibulin-3与MMP-9/TIMP-3在高血压病人血清中的表达及其与脉搏波传导速度的相关性目的：探讨高血压病人血清Fibulin-3、MMP-9与TIMP-3水平改变的临床意义及其与肱-踝脉搏波传导速度(branchial-ankle Pulse Wave Velocity, baPWV)的相关性在高血压血管重构的作用。方法：收集我院住院及门诊就诊高血压患者50例以及体检的健康人38例作为对照人群,所有入选者均于空腹抽取静脉血4毫升,经离心机3000转／分离心处理后,抽取上清液,放-80℃冰箱贮存。所有血标本成批以酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测血清Fibulin-3、MMP-9、 TIMP-3表达；采用脉搏波速度自动测定仪测定baPWV。结果：高血压病人血清Fibulin-3水平较正常人显著下降,差异有极显著统计学意义(52.64±24.30 ng/ml vs 78.44±23.37 ng/ml,P<0.001而两组间血清MMP-9和TIMP-3水平差异无统计学意义(40.82±13.73 ng/ml vs 40.57±11.29 ng/ml,P>0.05; 5.41±2.29ng/ml vs 6.32±2.67ng/ml, P>0.05);高血压病人肱-踝脉搏波传导速度(baPWV)较正常人显著升高,差异有极显著统计学意义(1725.28±366.86 cm/svs 1365.50±235.33 cm/s,P<0.001)=通过Peaeson相关性分析表明,所有研究对象血清Fibulin-3水平与baPWV之间呈负相关(r=-0.328,P=0.002)：而MMP-9和baPWV之间无相关性(r=-0.030, P=0.784); TIMP-3和baPWV之间无相关性(r=0.002,P=0.984)。结论：高血压血管重构存在细胞外基质的变化和动脉功能改变,检测血清Fibulin-3水平和baPWV可作为高血压早期反映动脉功能改变的指标之一,对判断高血压靶器官损害有一定帮助。