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α-淀粉酶又称淀粉-1,4-糊精酶,也命名为α-1,4-D-葡聚糖-葡萄糖苷水解酶,其作用于淀粉时,可以从淀粉、多聚糖或寡聚糖分子内部随机地切开α-1,4-葡萄糖苷键,产生葡萄糖、麦芽糖和低聚糖等。α-淀粉酶在食品、药品、纺织、造纸等工业领域广泛应用。超高温α-淀粉酶是指最适温度在90℃以上的α-淀粉酶,它具有更优越的的酶学特性,使得它更适用于淀粉的喷射液化工艺,提高淀粉加工生产效率,降低生产成本。枯草芽孢杆菌是一类革兰氏阳性杆状好氧型细菌,也是芽孢杆菌中的模式生物,被美国食品药物管理局（FDA）和中国农业部等部门批准为食品安全微生物（GRAS）。因此,利用枯草芽孢杆菌表达系统来生产酶制剂在工业上具有很大的价值。实验室前期对枯草芽孢杆菌表达系统有一定研究和改造,现拥有良好的枯草芽孢杆菌表达宿主。本研究将来源于极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus的超高温α-淀粉酶（PFA）基因在Bacillus subtilis中表达,并测定重组超高温α-淀粉酶的酶学性质。通过信号肽筛选、伴侣蛋白共表达和热处理等方式,有效提高PFA在枯草芽孢杆菌中重组表达的胞外酶活。最后在在摇瓶基础上,对发酵培养基成分和发酵条件进行优化,并对优化后的发酵液进行热处理。主要研究结果如下:（1）将极端嗜热古菌P.furiosus来源的超高温α-淀粉酶基因与表达载体pHY300PLK构建成重组质粒pHY300PLK-pfa,并转化宿主B.subtilis WS9中进行重组表达,测得重组菌株胞外酶活为18.33 U·m L-1。探究了重组超高温α-淀粉酶的酶学性质。酶学性质结果显示,重组超高温α-淀粉酶的最适反应温度为100℃,最适反应pH为5.0,且在100℃条件下处理4 h,还保有60%的酶活,重组酶具有非常好的热稳定性。（2）为了提高PFA的重组异源表达,通过应用高通量筛选系统,对枯草芽孢杆菌的173种信号肽进行筛选,得出两种优良信号肽,其中包括Sec途径的YfhK和另一种新的信号肽AspB’。用它们替换表达载体pHY300PLK-pfa上的原始信号肽来构建新的重组表达质粒,并转入宿主B.subtilis WS9中进行发酵培养。结果表明,在37℃下发酵培养60 h,以YfhK作为信号肽的重组菌株胞外酶活可达60.73 U·m L-1,胞外酶活提高了约3.31倍;以AspB’作为信号肽的重组菌株胞外酶活可达119.01 U·m L-1,提高约6.49倍。（3）对于极端嗜热古菌来源的超高温α-淀粉酶在嗜温宿主中异源表达会产生包涵体的问题,实验采用伴侣蛋白共表达策略来进行改善。伴侣蛋白有辅助蛋白折叠、使胞内前体蛋白保持可运输状态等功能。首先选择了来源于枯草芽孢杆菌的伴侣蛋白prsA,构建共表达重组质粒pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa,转入宿主B.subtilis WS9,在TB培养基中摇瓶发酵60 h,胞外酶活达134.15 U·m L-1。较初始表达,提高约7.32倍。再选择来源于嗜热古菌P.furiosus来源的伴侣蛋白Pfefoldinγ和PPlase。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术在B.subtilis WS9基因组中分别插入Pfefoldinγ和PPlase的基因,获得基因组上含有伴侣蛋白基因的宿主菌B.subtilis WS9dinγ和B.subtilis WS9PPlase。将重组质粒pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa转化这两种宿主菌,获得同时含有两种伴侣蛋白组合prsA/Pfefoldinγ和prsA/PPlase共表达的重组菌。两种重组菌摇瓶发酵培养60 h,胞外酶活分别可达145.54 U·m L-1,156.67 U·m L-1,较初始表达提高了约7.94倍和8.55倍。（4）在对重组菌发酵培养的过程中,发现重组菌株随着摇瓶发酵培养时间（≤300 h）的增加,酶活逐渐增加。超高温酶热稳定性较好,为了加快超高温α-淀粉酶的有效可溶性表达,对发酵后含菌体的发酵液进行热处理,发现该方法能明显提高超高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的可溶性表达。将重组菌B.subtilisWS9PPlase（pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa）发酵72 h,胞外酶活达233.26 U·mL-1,热处理（90℃水浴加热15 min）含菌体的发酵液样品,离心取上清,此时上清中的超高温α-淀粉酶酶活可达1456.65 U·mL-1。取发酵120 h含菌体的发酵液离心,彻底吸去上清,并加入1 m L去离子水悬浮菌体,90℃热处理15 min,离心获得水悬上清,测定各部分酶活,胞外上清酶活为673.19 U·mL-1,水悬上清酶活为1507.42 U·m L-1,此时总酶活达2108.61 U·mL-1。在摇瓶水平上对重组菌B.subtilis WS9PPlase（pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa）进行发酵条件优化。摇瓶优化结果显示最佳培养基组合成分为:18 g·L-1西王大豆蛋白胨和9 g·L-1的安琪酵母浸粉组成的复合氮源,5 g·L-1葡萄糖的碳源,10 mM Ca2+和3 mM Al3+的金属离子浓度,pH 7.0的初始培养基pH值,33℃的发酵培养温度。发酵培养60 h胞外酶活为282.60 U·m L-1,较优化前提高了约1.80倍。热处理含菌体的发酵液,此时胞外酶活可达1302.79 U·mL-1。摇瓶发酵相同时间内胞外酶活较初始表达总得提高约71.08倍。3-L罐发酵培养120 h,胞外可溶性酶活可达3806.69 U·mL-1。