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背景及目的急性白血病(acuteleukemia, AL)是一类原发于造血干细胞的恶性疾病。多种因素导致某一造血细胞系恶性增生,进入血流并浸润到组织和器官,从而引起贫血、出血、感染等一系列临床表现。相关研究表明物理、化学、病毒、遗传等因素均可能和白血病的发病有关。白血病发病中起主要作用的机制有原癌基因的转化、抑癌基因畸变及细胞凋亡受抑等。Wnt途径通过调控细胞的增殖、运动和分化在胚胎发育过程中起重要作用。Wnt途径的异常激活可促进肿瘤细胞生长、增殖,抑制细胞凋亡,研究表明90%的结直肠肿瘤可发现Wnt途径的异常激活,同时,目前越来越多的证据表明Wnt通路的异常激活与造血系统恶性疾病的发生密切相关,它可以促进慢性淋巴细胞白血病(CLL)及多发性骨髓瘤(MM)中恶性B淋巴细胞的增殖,可加速慢性粒细胞白血病(CML)由慢性期向加速期及急变期的转变。同源盒基因(homeoboxgenes, Hoxgenes),广泛存在于生物体内,在生物的发育和分化过程中起重要作用。尾型同源盒基因CDX2(caudal type homebox transcription factor2)在胚胎期发育过程中主要控制哺乳动物身体纵轴的分化和发育,是同原盒基因家族最重要一员。在正常成人体内CDX2在肠道上皮及胰腺有表达,而在乳腺、前列腺、肾脏、肝脏、骨髓和外周血无表达。文献报道,90%的急性单核细胞白血病患者的白血病细胞中高表达CDX2基因。Scholl等人通过对急性白血病患者研究,证明了CDX2基因的异常表达在恶性血液病中普遍存在。同时有研究表明,CDX2基因的表达受RA、Wnt和Fgf等通路的调控。Wnt通路的异常激活可导致CDX2基因的表达增高。近几年对Wnt通路上游抑癌基因SFRPs的研究发现,SFRP1、2、4、5启动子中均含有CpG岛结构,且CpG岛的频繁甲基化导致的基因沉默可以激活Wnt信号通路从而促使白血病细胞抵抗凋亡。地西他滨做为去甲基化药物,其抑制甲基化转移酶的作用较强。地西他滨是否可以通过对Wnt通路上游基因的去甲基化激活抑癌基因,从而在一定程度上关闭Wnt通路,下调CDX2基因的表达,目前国内外尚未见报道。本研究的目的是观察地西他滨对CDX2基因mRNA及蛋白表达的影响,同时分析该药在不同浓度下对白血病细胞系K562增殖及凋亡的影响,为该药在临床上用于治疗白血病提供实验室依据。方法1.WST-1法检测细胞增殖抑制率：采用终浓度分别为0.02μmol/L、0.2μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的地西他滨分别作用于K562细胞8h、16h、24h、32h、WST-1法检测并计算细胞增殖抑制率,根据增殖抑制率测得地西他滨作用的最佳时间及最佳浓度。2.流式细胞术检测细胞凋亡：采用终浓度为1μmol/L的地西他滨(最佳作用浓度)作用于处于对数生长期的K562细胞16h,应用流式细胞仪AnnexinV FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率。3. RT-PCR法检测CDX2mRNA的表达：于对数生长期的K562细胞中分别加入终浓度为0.02μmol/L、0.2μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、20μmol/L的地西他滨,加药16小时后应用RT-PCR法检测不同药物浓度下CDX2mRNA表达水平的变化。4. Western blot法检测CDX2蛋白的表达：分别加终浓度为0.2μmol/L、5μmol/L的地西他滨给处于对数生长期的K562细胞,处理16小时后,用Western blot法检测各组CDX2蛋白的表达变化。5.统计分析：采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析,采用单因素方差分析,用(x±s)表示统计学数据。检验水准设置为α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.WST-1结果显示：终浓度为0.2μmol/L、0.2μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的地西他滨加药16小时后,K562细胞增殖均受到不同程度的抑制,抑制率分别为(29.6±0.35)%,(36.5±0.94)%,(54.4±1.11)%,(70.3±2.12)%,(81.1±2.65)%,(88.2±3.13)%,与空白对照组(1.5±0.09)%相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)；不同浓度地西他滨组间两两比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。终浓度为1μmol/L的地西他滨加药8小时、16小时、24小时、32小时后,K562细胞增殖抑制率分别为(31.3±1.51)%,(54.4±1.11)%,(68.0±1.23)%,(68.8±1.28)%,与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)；且作用8小时与16小时差异具有统计学意义(P<0.01),但16小时与24、32小时的增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05),故确定作用16小时为地西他滨作用的最佳时间点。软件处理分析结果显示地西他滨在16小时的IC50为0.784μmol/L,接近1μmol/L,故将该浓度确定为地西他滨最佳作用浓度,进行随后的细胞凋亡以及CDX2蛋白表达变化的分析。2.流式细胞术结果显示：当1μmol/L的地西他滨作用于K562细胞16h后,AnnexinV FITC/PI双染结果显示细胞凋亡率为：(29.6±1.2)%,而对照组为(0.76±0.08)%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.01)。3. RT-PCR和Western blot结果显示：终浓度为0.02μmol/L、0.2μmol/L、1μmol/L、20μmol/L的地西他滨作用于K562细胞16小时后,CDX2mRNA表达水平分别为0.84±0.028,0.74±0.034,0.63±0.020,0.51±0.023,0.41±0.011,与空白对照组0.9.4±0.019相比,差异有显著统计学意义(P<0.01)；不同浓度地西他滨之间CDX2mRNA表达水平有显著差异(P<0.05)。终浓度为1μmol/L的地西他滨处理K562细胞16h后,CDX2蛋白相对表达量为0.90±0.046,与空白组1.20±0.057相比,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论1.不同浓度的地西他滨能够不同程度的抑制K562细胞的增殖,其抑制作用具有时间和浓度依赖性。1.地西他滨能明显诱导K562细胞凋亡。2.地西他滨能明显下调K562细胞CDX2mRNA及蛋白的表达。