论文部分内容阅读
目的探讨我国疟疾混合流行区间日疟原虫红内期候选抗原Duffy抗原结合蛋白(DBP)Ⅱ区基因多态性特点。方法从我国疟疾高发混合流行区云南省采集疟疾患者末梢血,制备血样干滤纸片,QIAamp DNA mini kit(QIAGEN,德国)试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA。根据间日疟原虫标准株Sal-Ⅰ株DBPⅡ区为目的扩增片段设计特异性引物,以间日疟原虫基因组DNA为模板,采用高保真DNA聚合酶(KOD-plus聚合酶,Toyobo,日本),聚合酶链反应(PCR)扩增DBPⅡ区基因。对扩增所得片段纯化后,用美国ABIPRIME测序仪进行基因测序。Sal-Ⅰ标准株作为参照,利用BIOEDIT软件对所获得的基因序列进行排序(alignment)分析,检测基因突变位点。以DnaSP4.50.3(http://www.ub.es.dnasp/)和MEGA4.0软件评估序列多态性。结果1、扩增了19个间日疟原虫DBPⅡ区(PvDBP RⅡ)基因序列600bp长度片段(碱基位点853～1452bp),编码200个氨基酸(密码子285～484)。2、我国间日疟原虫云南分离株与Sal-Ⅰ标准株(Cent ral American株)比较,碱基水平共有13处发生突变,占2.17%(13/600),导致12个氨基酸位点发生改变,占6.00%(12/200),其中A1134→G位点为同义突变,未导致相应氨基酸发生改变;核苷酸改变共产生9种基因型,相应产生9种氨基酸型,以A1151G-G1169A-T1270A基因型(相应氨基酸型为D384G-R390H-L424I)为主(26.3%)。在碱基和氨基酸水平上未发现插入和缺失。3、与国内外疟疾流行区PvDBP RⅡ氨基酸多态位点的观察比较显示,我国云南株PvDBP RⅡ氨基酸置换位点基本包含于国外报道的位点中,未发现地区特异性突变位点。4、核苷酸序列多态性分析结果显示π=0.0091(SE:0.0028);dn/ds=6.168(P＜0.05);Tajima’s D=1.21360(P＞0.10);Fu and Li’s D*=1.48091(P＜0.05),F*=1.62640(P＜0.05)。讨论比较我国(云南、浙江和湖北)分离株的结果与南美、中东地区PvDBPRⅡ的基因多态性发现,我国分离株PvDBP RⅡ基因突变位点相对有限,提示我国分离株红内期候选抗原DBP蛋白功能相对保守。本研究结果显示,云南地区的PvDBP RⅡ的突变位点较浙江和湖北地区报道的位点,新发现3处突变位点,但发生频率均较低,这对分析我国不同流行区间PvDBP RⅡ基因多态性具有一定的提示意义。另外本研究还发现N417K和W437R位点呈关联出现,提示针对该靶位开发的多价疫苗也可能对我国流行区有效。分析我国云南分离株PvDBP RⅡ的基因多态性的原因,可能整体上受到自然选择的影响,呈正向选择趋势。我国云南分离株PvDBP RⅡ基因多态性突变位点的一些特点及影响多态性的可能因素分析,可为以PvDBP RⅡ为基础建立有效传播阻断疫苗的研究提供一定的线索。结论1、与南美、中东、非洲等流行区相比,中国间日疟原虫混合流行区云南分离株PvDBP RⅡ的基因多态性相对有限。我国疟疾混合流行区云南与单一流行区湖北和浙江地区突变位点存在一定差异。2、分析我国云南分离株PvDBP RⅡ的基因多态性的原因可能为整体上受到自然选择的影响,呈正向选择趋势。