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羊毛是全球经济中重要的农产品。在绵羊育种中羊毛长度是最有价值的性状之一。研究发现FGF5(Fibroblast Growth Factor 5)是毛囊周期性生长的抑制因子,当小鼠的FGF5基因缺失时其被毛长度显著增加。产生这种现象的原因是FGF5基因的沉默可以延长毛发生长周期中的生长期,进而产生毛发长度增加的表型。近几年,CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR Associated 9)作为一种新型的基因组编辑技术被广为应用,它在原核胚时期即可对动物模型和家畜进行有效的遗传编辑。本研究通过原核注射Cas9 mRNA和sgRNA(Single Guide RNA)的方法,成功利用CRISPR/Cas9技术生产出FGF5基因敲除绵羊。本研究首先根据绵羊的密码子偏嗜性对酿脓链球菌SF370的Cas9基因序列进行密码子优化,提高其在绵羊体内的表达效率。在绵羊基因组中共筛选设计了 3个靶向FGF5基因的sgRNAs。将优化后的绵羊Cas9及sgRNAs序列亚克隆构建真核表达载体U6-CMV-Cas9-H1,用于最佳sgRNA筛选。本研究利用体外转录分别获得Cas9 mRNA和FGF5 sgRNAs后共同显微注射绵羊原核胚,免疫荧光及RT-PCR检测结果显示Cas9持续表达至8细胞期胚胎,sgRNAs持续存在至16细胞期胚胎。本研究收集了 158枚受精卵用于生产FGF5基因敲除绵羊,将155枚原核可见胚胎注射Cas9mRNA和sgRNAs后移植到53只受体羊体内,有14只受体羊怀孕,共产羔18只,其中包括4对双胞胎。经PCR及测序分析后共获得3只阳性羔羊,亚克隆测序结果显示3只阳性羔羊共发生3种FGF5基因编辑类型:Δ5bp、Δ13bp和Δ33bp。由于这3种小片段的缺失导致FGF5蛋白的初级结构和高级结构的改变,使得FGF5蛋白生物学功能的丧失。此外,在FGF5基因敲除的杂合子个体中,正常的FGF5的mRNA的表达量相比野生型显著下降(p<0.01)。在羊毛性状方面,我们发现FGF5敲除个体的羊毛的长度显著大于野生型个体(p<0.05)。综上,我们获得了具有长毛性状的FGF5敲除羊。这将为绵羊育种工作提供有效、快速的遗传改良方法,从而极大的促进羊毛产业的发展。