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蜱及蜱传病一直是困扰世界上众多国家和我国畜牧业发展的重大疾病,也是公共卫生面临的新问题,迫切需要寻找新的可持续控制策略。因此了解蜱的基本生理学分子基础,对于研究蜱及蜱传病的新型防治策略十分重要。蜱的繁殖力极强,一只饱血雌蜱正常产卵数千只,因此控制生殖是控制蜱的关键环节。蜱的消化为生殖提供了基础,而消化酶在蜱的消化过程中起着重要作用,镰形扇头蜱肠道丝氨酸蛋白酶抑制分子RHS-2是否具有通过抑制相关消化酶的功能来影响蜱的有关消化,其作用机制还不清楚。镰形扇头蜱肠道丝氨酸蛋白酶抑制分子(RHS-2)为上海兽医研究所鉴定的消化相关分子,对丝氨酸酶具有抑制活性。为了进一步阐明其在蜱消化上的作用,本研究主要从三个方面开展研究,一是研究RHS-2是否具有非丝氨酸消化酶的抑制作用。二是研究了RHS-2表达位置、变化和分布特征,三是通过RHS-2干扰后的蜱粪便蛋白组学比较研究,分析RHS-2在血液消化方面的作用特点。1、构建p Cold-1/RHS-2重组表达质粒,转化到BL21宿主菌,IPTG诱导表达,得到重组蛋白。分析其对组织蛋白酶C、D、L、G、K和木瓜蛋白酶的酶活抑制作用。结果表明重组蛋白对六种消化蛋白活性酶均能产生不同程度的抑制作用,对组织蛋白酶L的活性抑制作用最高,对木瓜蛋白酶抑制效率次之,对组织蛋白酶D、K、G抑制效率较弱,而对组织蛋白酶C抑制效率最低。2、免疫荧光和免疫组化测定RHS-2表达部位,结果表明RHS-2集中在中肠的外壁细胞表达。提取中肠蛋白,通过免疫转印技术检测RHS-2表达的变化特征发现,RHS-2干扰组蛋白表达下降,其中第三天下降较第六天更为明显。3、用显微注射方法,分别对实验组和对照组的未吸血雌性成蜱注射RHS-2的ds RNA和对照Lucifrase分子的ds RNA。然后将蜱接种于新西兰大白兔,分别采集吸血第4天和第8天的蜱粪便。采用Label free的方法对收集的粪便进行蛋白组分析。结果共鉴定蜱源蛋白198种、兔源蛋白697种;吸血第4天干扰组与对照组相比,差异蛋白分子38个;吸血第8天干扰组与对照组相比,差异蛋白分子39个。其中蜱源差异蛋白主要是热休克蛋白、免疫蛋白相关亚基、蛋白酶类等,兔源差异蛋白主要为凝血因子、糖蛋白及一些与消化、合成的相关的酶类如兔丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、三磷酸肌苷焦磷酸酶、S-(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶等。上述结果表明:RHS-2主要定位于蜱中肠肠腔外壁细胞,对多种消化蛋白酶均能产生不同程度的抑制活性,对宿主蛋白和自身蛋白的消化产生影响,从而影响蜱的消化功能。这些结果,有助于我们对serpin分子在消化作用上的理解,了解蜱的基本生理学分子基础。