副交感神经M1受体参与自噬并影响前列腺癌进展的研究

来源 :重庆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dianzishu1981
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目的:探讨副交感神经M1受体(muscarinic acetylcholine M1receptor,CHRM1)与前列腺癌细胞增殖、转移与抗凋亡之间的关系。初步探索CHRM1参与细胞自噬,并且影响肿瘤细胞进展及其可能的分子机制。方法:(1)选用裸鼠皮下成瘤法、Western blot、免疫荧光等方法观察CHRM1在前列腺癌组织及人体外细胞中表达情况。(2)体外培养前列腺癌细胞系细胞PC-3、LNCaP、DU145,用慢病毒感染方法建立CHRM1稳定敲低的细胞模型,加入其激动剂与抑制剂进行实验,用CCK8细胞增殖实验及平板克隆实验检测CHRM1对前列腺癌细胞增殖能力与细胞克隆能力,选用Transwell和细胞划痕试验检测细胞迁移与侵袭能力,选用流式细胞术和透射电镜下观察凋亡小体方法检测细胞凋亡情况。(3)稳定敲低CHRM1或加入抑制剂,选用qPCR、Western blot方法检测CHRM1对前列腺癌细胞上皮间质转化(EMT)相关的基因及蛋白表达水平。(4)选用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)及转染LC3的质粒等方法饥饿诱导前列腺癌细胞检测其细胞自噬水平。(5)上调或下调CHRM1表达,应用透射电镜观察自噬小体,用Western blot、免疫荧光等方法检测自噬相关标志物LC3、p62表达及自噬流变化情况。(6)选用细胞迁移与侵袭试验,在前列腺癌各细胞系细胞中加入3-MA、CAR、PIN后检测CHRM1诱导的细胞自噬对肿瘤细胞迁移侵袭能力改变情况。(7)稳定敲低CHRM1后,在转录与翻译水平上分别检测自噬相关基因表达情况。发现自噬基因Atg5与CHRM1高度正相关,后建立Atg5稳定敲低模型,通过细胞迁移与侵袭试验检测CHRM1是否靶向Atg5来调控细胞自噬影响前列腺癌细胞侵袭迁移能力。(8)稳定敲低CHRM1或再加入激动剂,选用Western blot方法检测AMPK/mTOR信号通路中p-AMPK、p-mTOR等蛋白表达水平。结果:(1)副交感神经M1受体大量表达在前列腺癌各细胞系细胞中。(2)CHRM1激活提高前列腺癌细胞的增殖能力、克隆形成水平、转移能力及抗凋亡水平。(3)在前列腺癌细胞中,CHRM1激活促进其上皮间质间转换进程。(4)前列腺癌细胞PC-3、LNCaP、DU145能够在饥饿条件下诱导细胞自噬发生。(5)在前列腺癌细胞中,CHRM1激活后透射电镜下观察到大量自噬小体,LC3蛋白表达增加,镜下观察到LC3颗粒增多,并且能够促进自噬流的流动,而敲低CHRM1或加入PIN后得到相反结果,提示CHRM1激活可以诱导细胞自噬发生。(6)阻断自噬后,前列腺癌细胞迁移和侵袭能力被一定程度抑制。在CAR存在情况下抑制自噬可以降低CAR对细胞的迁移与侵袭水平,具有统计学意义,提示CHRM1可能通过激活自噬水平增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。(7)敲低CHRM1后检测自噬相关基因表达,发现CHRM1与Atg5高度正相关。下调Atg5极大地抑制了前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力,提示CHRM1激活后诱导自噬调控肿瘤细胞转移进程与Atg5正相关。(8)敲低CHRM1后检测蛋白表达发现p-AMPK降低,p-mTOR升高,提示CHRM1可能通过AMPK/mTOR途径在前列腺癌中诱导自噬从而调控肿瘤细胞进展。结论:CHRM1大量表达在前列腺癌细胞中,促进前列腺癌增殖、转移并抵抗肿瘤细胞凋亡。CHRM1可能靶向Atg5通过AMPK/mTOR通路在前列腺癌中诱导自噬并介导前列腺癌细胞转移。
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