背景:急性下肢缺血再灌注损伤是指短时间内下肢急性缺血,而重新恢复其血流后导致下肢缺血性损伤进一步加重的现象。常见于腹主动脉瘤、急性动脉栓塞等疾病手术治疗中长时间使用夹血带止血后再恢复血流的情况。急性下肢缺血再灌注损伤常常伴随出现机体氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和组织损伤,甚至损害心、肺、肾和循环系统的生理功能。氢气具有弱还原性,可发挥抗氧化作用,能够有选择性地清除羟自由基。由于氢分子较小,能穿过细胞膜进入细胞器,因此作为缺血再灌注防治因子具有很大的优势,吸引了很多学者展开氢对缺血再灌注保护作用的研究。本课题以大鼠下肢急性缺血再灌注损伤为模型,拟探讨氢对大鼠下肢急性缺血再灌注损伤的保护作用,并初步探讨其作用的机制。由于氢的气体形式在应用过程中存在很多问题,因此我们将采用氢生理盐水进行研究。目的:通过建立大鼠下肢急性缺血再灌注模型,探讨氢分子对大鼠下肢急性缺血再灌注的保护作用及其作用机制。为临床上应用氢分子缓解治疗急性下肢缺血再灌注损伤提供理论基础。方法:1、急性下肢缺血再灌注模型:采用游离股动脉、股静脉和股神经的方法,游离股动脉约10mm,以Bulldog无创血管阻断钳夹闭股动脉,远端股动脉置管测压,血压为零标志缺血成功;到达预定时间点(本研究为缺血4小时)后去除动脉夹,恢复下肢血供血压升高标志再灌注成功。2、长期给药实验中,大鼠急性下肢缺血再灌注造模成功后第1、3、5、7、9天,称取大鼠体重,釆用姿势反射试验、肢体不对称试验两种方法作为行为学评价指标,观察氢生理盐水对大鼠缺血再灌注损伤后运动功能康复的影响。3、短期给药实验中,每组大鼠于再灌注15小时后切取下肢肌肉组织及肝、肺、肾组织,经甲醛中固定、石蜡包埋、冰冻切片获得组织切片。4、组织损伤检测:(1)采用he染色法进行组织切片染色,观察组织形态学结构变化和炎性浸润。(2)运用自动生化分析仪检测肌红蛋白(mb)、脂蛋白复合物(lpc)、脂质过氧化物(lpo)等组织坏死分解产物。(3)采用比色法检测骨骼肌组织中血浆中乳酸脱氢酶(ldh)、肌酸激酶(ck)的含量。5、炎性程度检测:采用elisa法测定各组血清中il-1、il-6、tnf-α、hmgb1的浓度。6、氧化程度检测:采用比色法检测组织及线粒体中mda、gsh、gssg的含量,观察组织及线粒体氧化反应程度。7、线粒体结构与功能检测:(1)差速离心法分离肌肉组织细胞线粒体及胞浆。(2)透射电镜观察骨骼肌细胞线粒体形态改变。(3)采用分光光度法检测线粒体膜势能以及线粒体中atp的变化,clark氧电极法检测线粒体呼吸功能,观察线粒体损伤情况。8、细胞凋亡检测:(1)采用tunel染色法检测骨骼肌组织细胞凋亡。(2)采用免疫印迹方法检测组织中细胞色素c、bax、pro-caspase9和caspase3等凋亡相关蛋白的含量。结果:1、氢生理盐水对大鼠急性下肢缺血再灌注后骨骼肌及远隔组织损伤的影响(1)组织形态学结果显示,不管是骨骼肌还是远隔器官肝、肺、肾组织,氢生理盐水处理的组较对照组由下肢缺血再灌注引起的组织损伤明显减轻,可见组织形态相对完整、组织细胞凋亡坏死减少、且炎性细胞浸润明显减轻等。(2)我们发现氢生理盐水能明显降低下肢缺血再灌注引起的骨骼肌及远隔组织中肌红蛋白(mb)、脂蛋白复合物(lpc)、脂质过氧化物(lpo)等组织坏死分解产物的升高。(3)我们还检测到实验组相对于对照组大鼠血清中乳酸脱氢酶(ldh)、肌酸激酶(ck)的下降。2、氢生理盐水对大鼠急性下肢缺血再灌注炎性反应的影响普通生理盐水组大鼠血清中炎性因子il-1、il-6、tnf-α、hmgb1的含量较假手术组明显升高,而氢生理盐水组大鼠血清中炎性因子il-1、il-6、tnf-α、hmgb1的含量较普通生理盐水组明显降低。3、氢生理盐水对大鼠下肢骨骼肌缺血再灌注氧化应激的影响下肢缺血再灌注后大鼠骨骼肌及肝、肺、肾组织中mda和gssg的水平明显升高,而gsh的含量明显下降,说明缺血再灌注后骨骼肌及肝、肺、肾组织中的氧化应激明显增强,而氢生理盐水处理则能明显降低mda和gssg的水平,并提高gsh的含量。说明氢生理盐水可以有效抑制下肢缺血再灌注引起的骨骼肌及远端器官肝、肺、肾的氧化应激。4、氢生理盐水对大鼠缺血再灌注损伤后运动功能康复的影响缺血再灌注后,大鼠的姿势反射功能受损,以第1天、第3天、第5天统计学有显著性差异,而第7天后,姿势反射功能有所恢复,而氢生理盐水的处理使得大鼠姿势反射功能受损减轻,以第3天和第5天有显著性差异;缺血再灌注后,大鼠的肢体对称性变差,以第1天、第3天统计学有显著性差异,第5天后,肢体对称性有所恢复,而氢生理盐水的处理使得大鼠肢体对称性受损减轻,以第3天有显著性差异。说明氢生理盐水可明显改善下肢缺血再灌注引起的大鼠肢体运动功能损伤。另外,氢生理盐水处理可使得缺血再灌注引起的大鼠体重下降明显改善。5、氢生理盐水对大鼠下肢缺血再灌注后骨骼肌线粒体的影响。(1)透射电镜观察可以看出,下肢缺血再灌注大鼠骨骼肌细胞线粒体形状出现大小形态不规则、肿胀、线粒体嵴紊乱不清晰、线粒体基质凝聚;而氢生理盐水处理的大鼠缺血再灌注组大鼠骨骼肌细胞线粒体则大小形态均匀一致、线粒体嵴及线粒体基质结构清晰规则、较少出现肿胀情况。(2)大鼠下肢缺血再灌注后,线粒体膜势能相比假手术组大幅度降低,而氢生理盐水处理组线粒体膜势能高于对照组。这说明氢生理盐水处理可以在下肢受到缺血再灌注时帮助线粒体维持其膜势能,维持线粒体渗透压平衡,保护线粒体的结构免受损伤。(3)通过检测不同组大鼠下肢骨骼肌细胞线粒体中mda、gsh、gssg的含量,发现大鼠下肢缺血再灌注组mda、gsh、gssg的含量较假手术组明显上升,而氢生理盐水组较普通生理盐水组mda、gsh、gssg的含量明显下降。(4)大鼠下肢缺血再灌注可增强骨骼肌细胞线粒体中atp的消耗,增强线粒体的氧化反应程度,而氢生理盐水组大鼠线粒体中atp的消耗明显低于普通生理盐水组。与之一致的是,氢生理盐水组大鼠线粒体中的磷氧比明显高于普通生理盐水组。6、氢生理盐水对大鼠下肢缺血再灌注后骨骼肌组织细胞凋亡的影响(1)tunel染色结果显示,假手术组凋亡细胞较少,而相较于假手术组缺血再灌注后对照组大鼠骨骼肌组织细胞凋亡明显增加,而氢生理盐水处理的实验组相较于对照组凋亡明显下降。(2)假手术组中,bax的表达以在细胞质为主,而对照组中bax的表达在线粒体中显著增强,而在细胞质中表达下降,说明下肢缺血再灌注损伤时bax可能由细胞质像线粒体转移,而氢生理盐水干预后导致bax的表达相对于对照组在细胞质中增加,在线粒体中的表达相对对照组下降。细胞色素c的表达与bax呈相反的趋势。(3)缺血再灌注后对照组骨骼肌细胞中pro-caspase9和caspase3的表达明显高于假手术组,统计学有显著性差异;而氢生理盐水处理后,骨骼肌细胞中pro-caspase9和caspase3的表达较对照组明显下降。结论:本文运用大鼠急性下肢缺血再灌注损伤模型,并在再灌注时进行氢生理盐水处理,对缺血再灌注后大鼠骨骼肌损伤、炎性反应、氧化应激、线粒体功能、细胞凋亡等进行检测和分析,得到以下结论:1、氢生理盐水能明显减轻下肢缺血再灌注诱导的骨骼肌及远隔器官损伤。2、氢生理盐水能有效抑制下肢缺血再灌注引起的氧化应激。3、氢生理盐水能有效减轻下肢缺血再灌注诱导的骨骼肌炎性反应。4、氢生理盐水能明显改善下肢缺血再灌注后大鼠运动功能康复。5、氢生理盐水能明显减轻缺血再灌注引起的骨骼肌线粒体损伤。(1)氢生理盐水能保护缺血再灌注时线粒体的结构。(2)氢生理盐水能抑制骨骼肌细胞线粒体ATP消耗、呼吸控制率及磷氧比的降低来保护线粒体的功能。6、氢生理盐水能抑制下肢缺血再灌注引起的骨骼肌细胞凋亡。(1)氢生理盐水能调节骨骼肌细胞中细胞色素C和凋亡蛋白Bax的表达。(2)氢生理盐水调节骨骼肌细胞中Pro-caspase9和caspase3的表达。综上所述,我们的研究显示尾静脉注射氢生理盐水可以明显抑制大鼠急性下肢缺血再灌注引起的细胞线粒体结构与功能损伤,进而提高线粒体的抗氧化能力,抑制线粒体氧化应激,减轻线粒体所受氧化损伤,另外,氢生理盐水使得线粒体膜势能得以维持,调控Bax和细胞色素C在线粒体与细胞质中的分布,并且抑制Pro-caspase9的激活、抑制凋亡下游分子caspase3的表达,从而抑制细胞凋亡。尾静脉注射氢生理盐水还可以降低骨骼肌及远隔器官肝、肺、肾的氧化应激,提高组织的抗氧化能力,并能通过抑制骨骼肌及远隔器官肝、肺、肾中的炎性细胞聚集及炎性因子释放,显著减轻组织的炎症程度,从而有效保护下肢缺血再灌注引起的骨骼肌及远隔器官肝、肺、肾的功能损伤,有助于大鼠运动功能恢复且显著改善大鼠的身体状态。为氢生理盐水应用于辅助治疗下肢缺血再灌注引起的损伤提供理论支持。