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第一部分整合素α4、β7基因克隆目的:从小鼠小肠peyer结中克隆小鼠整合素α4、β7基因,为下一步利用腺病毒载体AdEasy system构建Adα4β7打下基础。方法:以小鼠小肠PP提取的总RNA为模板,设计合成扩增小鼠整合素α4、β7基因的特异性引物,进行RT-PCR反应。应用胶回收法纯化目的基因α4、β7,目的基因定向克隆至载体pMD-18, pMD-19,构建质粒pMD-18-α4、pMD-19-β7,进行测序,与已知GenBank中的α4、β7基因进行序列比较,对导致编码氨基酸改变的突变碱基进行定点突变修复。结果:克隆α4、β7基因,序列测定表明α4基因序列有6个碱基突变导致编码氨基酸的改变,β7基因序列有5个碱基突变导致编码氨基酸的改变。利用定点突变技术对造成编码氨基酸的碱基定点突变修复。结论:本研究成功克隆小鼠α4、β7基因,确定对造成编码氨基酸改变的突变碱基定点突变修复。第二部分构建重组腺病毒AdCTLA4Ig、Adα4β7目的:应用腺病毒载体系统AdEasy System构建含有CTLA4Ig、α4β7基因的重组腺病毒AdCTLA4Ig、Adα4β7及其对照腺病毒AdGFP,从pIRES2-EGFP克隆IRES序列用于将α4、β7基因连接并插入同一基因表达盒,为进一步应用其进行诱导树突状细胞免疫耐受、定植到肠道淋巴组织研究打下基础。方法:1、将目的基因CTLA4Ig克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,碱裂解法提取质粒,酶切使之线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAdCTLA4Ig;将穿梭质粒pAdTrack-CMV直接酶切使之线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAdGFP,将重组腺病毒质粒pAdCTLA4Ig、pAdGFP以酶切法及PCR法进行鉴定。重组腺病毒质粒用Pac I线性化后转染293细胞,于荧光显微镜下观察绿色荧光以确定转染效果。2、将目的基因α4、β7基因、IRES序列分别克隆至穿梭质粒pAdshuttle-CMV,碱裂解法提取质粒,酶切使之线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内进行同源重组,构建重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒以酶切法及PCR法进行鉴定。重组腺病毒质粒用Pac I线性化后转染293细胞,用PCR法鉴定构建效果,用Western Blot法确定目的基因表达。结果:1、重组腺病毒质粒pAdCTLA4Ig、pAdGFP经Pac I酶切后可见4.5kb和一条约30kb的条带,表明同源重组成功。将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞后于荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光。将收集的病毒液做PCR鉴定,结果表明重组腺病毒AdCTLA4Ig、AdGFP构建成功。2、重组腺病毒质粒pAdα4β7经Pac I酶切后可见4.5kb和一条约30kb的条带,表明同源重组成功。将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞后,将收集的病毒液做PCR鉴定,结果表明重组腺病毒Adα4β7构建成功,Western Blot法检测表明有目的基因α4β7表达。结论:成功构建了重组腺病毒AdCTLA4Ig、Adα4β7及对照腺病毒AdGFP。第三部分腺病毒转导CTLA4Ig、α4β7基因修饰树突状细胞及功能检测目的:从小鼠骨髓分离培养树突状细胞,建立体外原代培养树突状细胞的方法,确定影响树突状细胞成熟的因素和CTLA4Ig、α4β7表达效率,构建稳定编码CTLA4Ig和α4β7腺病毒转导树突状细胞疫苗。方法:从小鼠胫骨和股骨冲洗出骨髓,制成细胞悬液,在GM-CSF和IL-4作用下,体外培养7天。光学显微镜下观察细胞生长状况和形态学变化。流式细胞术(FACS)鉴定转导细胞表型,确定为树突状细胞后,感染重组腺病毒并与OVA共育。FACS鉴定细胞成熟状态,荧光显微镜观察细胞内报告基因表达和细胞生存状态,Wesern Blot法测定目的基因表达,激光共聚焦检测CTLA4Ig和α4β7两种蛋白分子在同一细胞的表达情况;树突状细胞与T淋巴细胞混合培养,MTT法检测T淋巴细胞增殖,TUNEL法检测T淋巴细胞凋亡。结果:50%左右树突状细胞具有CD11c表型,确定为树突状细胞。CTLA4Ig蛋白位置接近53kDa的蛋白条带,α4β7蛋白分子位置接近198kDa的蛋白条带。50%左右细胞同时表达CTLA4Ig和α4β7两种蛋白分子。CTLA4Ig和α4β7基因表达的树突状细胞明显抑制T淋巴细胞增殖、促进T淋巴细胞凋亡。结论:腺病毒转导基因CTLA4Ig和α4β7修饰树突状细胞可使树突状细胞同时表达CTLA4Ig和α4β7两种蛋白分子,共刺激分子CD86和CD80减少,抑制T淋巴细胞增殖,促进T淋巴细胞凋亡。